高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物医药中哺乳动物细胞培养技术领域，具体而言，涉及高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用。本发明专利技术在N‑1种子细胞培养和后续(可选的)扩大培养中，通过流加补料培养增加活细胞密度。便于放大至生产规模，操作简单，成本低廉；还可以在更短的周期获得相同或更高产量和质量的蛋白，并在相同的生产周期可以获得更高的蛋白产量，可提高＞20％的产量。

【技术实现步骤摘要】
高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用
本专利技术涉及生物医药中哺乳动物细胞培养
，具体而言，涉及高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用。
技术介绍
生物医药是生物技术产业与医药产业相结合，共同组成的新型产业。随着生物技术的不断突破和创新，及在医药领域的成熟应用，大批医药生物技术产品(包括基因工程药物，疫苗，生物诊断试剂等)大量涌出。尤其进入21世纪后，生物医药的发展日新月异，到目前为止，已有上百种单克隆抗体药物上市和处于研发阶段，人们对生物制药的兴趣也越发浓厚。其较低的毒副作用、高特异性治疗功效、较长的半衰期和平台化的生产工艺技术等特点，使单抗在治疗生物制品领域处于领导地位，是最成功的一类生物制品。迄今，大部分的单抗都是由哺乳动物细胞表达，其研发和商业性生产均是在生物反应器中进行的，其常见工作体积规模从几升至数千升不等。抗体药物研发工艺包括细胞株构建及单克隆筛选、细胞培养、纯化和制剂四个方面，生产工艺则为上游细胞培养、下游纯化、制剂灌装三个方面。其中又以上游工艺最为关键。由于哺乳动物细胞的生长及表达特性，决定了其培养周期长，从而使得抗体药物研发周期长，投资高，商业化生产成本高；这也是目前单抗药物价格高昂的主要原因。为了降低生物医药价格，惠及全人类，人们不断探索，从高表达细胞株的构建和筛选到培养工艺及方式的优化等等。得益于基因工程技术的发展，细胞株的表达量获得极大的提高，传统的细胞培养工艺也得到优化，从低密度接种培养到高密度接种培养，从批次培养模式、补料流加到连续流培养模式。如何在高密度接种培养时缩短培养周期、提高目标蛋白的产量，进而降低整体的培养成本，是提高整体培养效率的关键问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种在N-1种子扩增时通过流加补料培养基后获得高活细胞密度的培养方法。本专利技术的目的之二是提供一种高活细胞密度接种的细胞培养方式。本专利技术的目的之三是通过上述方法在哺乳动物细胞中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术涉及一种用于高密度接种培养中种子细胞的培养方法，包括：在N-1种子扩增培养时通过流加补料培养增加种子活细胞密度。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及一种高密度接种细胞培养的方法，包括：1)应用如上所述的方法培养得到种子细胞；2)将所述种子细胞接种于生物反应器中进行放大培养。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及上述方法在哺乳动物细胞中的应用。缩短上游培养工艺周期或者相同的生产周期提高产量，从而降低成本。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)便于放大至生产规模，操作简单，成本低廉。(2)可以在更短的周期获得相同或更高产量和质量的蛋白。(3)在相同的生产周期可以获得更高的蛋白产量，可提高＞20％的产量。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1提供的N-1细胞扩增生长图谱；图2为本专利技术实施例1提供的NProduction阶段细胞生长对比图谱；图3为本专利技术实施例1提供的NProduction阶段细胞生产对比图谱；图4为本专利技术实施例1提供的NProduction阶段蛋白产量对比图谱；图5为本专利技术实施例2提供的N-1细胞扩增生长图谱；图6为本专利技术实施例2提供的NProduction阶段细胞生长对比图谱；图7为本专利技术实施例2提供的NProduction阶段细胞生产对比图谱；图8为本专利技术实施例2提供的NProduction阶段蛋白产量对比图谱。具体实施方式本专利技术涉及一种用于高密度接种培养中种子细胞的培养方法，包括：在N-1种子扩增培养时通过流加补料培养增加种子活细胞密度。在一些实施方式中，所述流加补料的补料形式为补加基础培养基、补料培养基或氨基酸营养源。此处所用的术语“流加补料培养”为一种在培养过程起始后，持续或半持续地向培养物中供以额外成分的细胞培养方法，且整个培养过程中没有培养基流出。所提供的成分一般包括在培养过程中消耗的细胞营养添加剂。“培养物”、“细胞培养物”，和“哺乳动物细胞培养物”：此处所用的这些术语是指在适于细胞群存活和/或生长的条件下，悬浮于培养基(见下文“培养基”定义)内的哺乳动物细胞群。对本领域普通技术人员显而易见的是，此处所用的这些术语也指包含哺乳动物细胞群和细胞群悬浮于其中的培养基的组合。“培养基”、“细胞培养基”：此处所用的这些术语是指含有滋养哺乳动物细胞生长的营养素的溶液。一般而言，这些溶液提供细胞基本生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和微量元素。溶液中也可含有促进最低速率以上生长和/或存活的成分，包括激素和生长因子。所述溶液优选配制为适于细胞存活和增殖的pH和盐浓度。培养基也可为“限定培养基”——不含蛋白质、水解产物或未知组合物成分的无血清培养基。限定培养基中不含有动物来源的成分，并且其所有成分均具有已知的化学结构。在一些实施方式中，N-1种子扩增培养的细胞起始密度至少为0.25×106cells/ml；在一些实施方式中，N-1种子扩增培养的细胞起始密度为0.25～0.50×106cells/ml；在一些实施方式中，N-1种子扩增培养的细胞起始密度为0.3±0.05×106cells/ml。在本申请中，所用的术语“细胞密度”是指在指定体积培养基中存在的细胞数目，通常以活细胞数计。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及一种高密度接种细胞培养的方法，包括：1)应用如上所述的方法培养得到种子细胞；2)将所述种子细胞接种于生物反应器中进行放大培养。此处所用的术语“生物反应器”是指用于哺乳动物细胞培养物生长的任何容器。只要能用于培养哺乳动物细胞，生物反应器可为任意大小。一般而言，生物反应器为至少1升，也可为10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10000、120000升或更大，或其间任意容积。一般在培养期间调控生物反应器的内部条件，包括但不仅限于pH和温度。生物反应器可以由适于容纳在本专利技术培养条件下悬浮于培养基内的哺乳动物细胞培养物的任何材料构成，包括玻璃、塑料或金属。此处所用的术语“生产生物反应器”是指用于生产目的多肽或蛋白质的终末生物反应器。大规模细胞培养物生产生物反应器的容积一般至少为50升，也可为100、150、200、500、1000、2500、5000、8000、10000、120000升或更大，或其间任意容积。本领域普通技术人员应当了解并能够选择合适的生物反应器用于实施本专利技术。此处所用的术语“接种”是指将细胞培养物供予生物反应器或另一容器的方法。之前细胞可在另一生物反应器或容器中增殖。或者细胞为冰冻并于供予生物反应器或容器之前解冻。该术语用于指任意数目细胞，包括单个细胞。在一些实施方式中，在步骤1)中，当种子活细胞密度≥15×106cells/ml时终止培养。在一些实施方式中，在步骤2)中，所述种子细胞接种的密度≥2×106cells/ml；在一些实施方式中，所述种子细胞接种的密度为2～5×106cel本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于高密度接种培养中种子细胞的培养方法，其特征在于，包括：在N‑1种子扩增培养时通过流加补料培养增加种子活细胞密度。

【技术特征摘要】
1.一种用于高密度接种培养中种子细胞的培养方法，其特征在于，包括：在N-1种子扩增培养时通过流加补料培养增加种子活细胞密度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流加补料的补料形式为补加基础培养基、补料培养基或氨基酸营养源。3.一种高密度接种细胞培养的方法，其特征在于，包括：1)应用权利要求1或2所述的方法培养得到种子细胞；2)将所述种子细胞接种于生物反应器中进行放大培养。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，当种子活细胞密度≥15×106cells/ml时终止培养。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述种子细胞接种的密度≥2×106cells/ml；优选为3.0±0.5×106cells/ml。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)采用流加补料培养方式进行细胞培养。7.权利要求1或2所述的方法，或权利要求3～6任...

【专利技术属性】
技术研发人员：代争，廖元霆，
申请(专利权)人：杭州奕安济世生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33