用于转导淋巴细胞及调节其活性的方法及组合物技术

本公开提供了用于遗传修饰淋巴细胞的方法及用于执行包括转导T细胞和/或NK细胞的过继性细胞疗法的方法。所述方法可包括抑制性RNA分子和/或可包括淋巴增殖性元件的经改造信号传导多肽和/或嵌合抗原受体(CAR)，例如微环境限制的生物CAR(MRB‑CAR)。本文中提供此类经改造信号传导多肽的额外元件，例如驱动增殖的那些和其调控元件，以及复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒及包装细胞系及其制备方法。提供用于调节经转导和/或遗传修饰的T细胞和/或NK细胞的一些元件及方法，例如，包括核糖开关，MRB‑CAR，识别结构域和/或pH值调节剂的元件及方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于转导淋巴细胞及调节其活性的方法及组合物相关申请案的交叉参考本申请案主张申请案2017年3月19日申请的国际申请案第PCT/US2017/023112号，2017年3月19日申请的美国专利申请案第15/462855号，2016年7月8日申请的美国临时申请案第62/360041号及2017年3月3日申请的美国临时申请案第62/467039号的权益；国际申请案第PCT/US2017/023112号主张2016年3月19日申请的美国临时申请案第62/390093号，2016年7月8日申请的美国临时申请案第62/360041号及2017年3月3日申请的美国临时申请案第62/467039号的权益；美国申请案第15/462855号主张2016年3月19日申请的美国临时申请案第62/390093号，2016年7月8日申请的美国临时申请案第62/360041号及2017年3月3日申请的美国临时申请案第62/467039号的权益。本段所引用的这些申请案以全文引用的方式并入本文中。序列表本申请案在此通过引用的方式并入与本申请案一起提交的电子序列表材料。电子序列表中的材料提交为在2017年7月8日创建的标题为“F1_001_WO_02_Sequence_2017_07_08.txt”的文本(.txt)文档(其文档大小为268KB)，且以全文引用的方式并入本文中。
本公开内容涉及免疫学领域，更具体的说，涉及T淋巴细胞或其他免疫细胞的遗传修饰，及制备复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒及控制其中基因表达的方法。
技术介绍
从受试者(例如患者)分离的淋巴细胞可在体外活化且经遗传修饰以表达合成蛋白，这样的合成蛋白能够基于所整合入的遗传程序而与其他细胞及环境重定向接合。嵌合抗原受体(CAR)就是此类合成蛋白的一个例子。目前使用的一种CAR是由复制缺陷型重组逆转录病毒编码的一个或多个胞内信号传导域、跨膜结构域和胞外识别结构域(例如，抗原结合结构域)的融合。尽管重组逆转录病毒已在感染非分裂细胞上显示功效，但静息CD4及CD8淋巴细胞对这类载体的基因转导不敏感。为了解决这个问题，通常在可出现对CAR基因载体的遗传修饰之前使用刺激试剂在体外活化这些细胞。在刺激及转导之后，经遗传修饰的细胞在体外扩增并随后重新引入淋巴细胞清除(lymphodepleted)的患者。在体内抗原接合之后，CAR胞内信号传导部分可在免疫细胞中开始活化相关的反应并释放细胞溶解分子以诱导肿瘤细胞死亡。目前此类的方法需要大量的操作和生产，即在T细胞回输注至患者之前在体外增殖T细胞，以及淋巴细胞清除化学疗法以释放细胞因子并消耗竞争性受体从而促进T细胞植入。一旦引入体内，这种CAR疗法不能继续控制体内传播速率，也不能安全地定向又在肿瘤外表达的靶标。因此，现今CAR疗法一般由使用1×105个细胞/公斤至1×108个细胞/公斤的剂量离体扩增12天至28天的细胞输注，且所定向的靶标(例如肿瘤靶标)为在靶脱瘤毒性(offtumorontargettoxicity)一般是可接受的靶标。这些相对长的离体扩增时间产生细胞存活性及无菌性问题，以及样品一致性和可扩展性的挑战。因此，极为需要一种更安全，更有效的可扩展的T细胞或NK细胞疗法。专利技术概述本文中提供帮助克服用于转导和/或遗传修饰淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)以及用这些细胞执行过继性细胞疗法的方法的有效性及安全性有关问题的方法、组合物和试剂盒。因此，在一些方面中，本文中提供用于遗传修饰和/或转导淋巴细胞(尤其T细胞和/或NK细胞)和/或用于调节经转导和/或遗传修饰的T细胞和/或NK细胞的活性的方法，组合物及试剂盒。这些方法，组合物及试剂盒提供较目前技术更加改善的功效及安全性，尤其关于表达嵌合抗原受体(CAR)及在说明性实施方式中微环境限制的生物CAR的T细胞和/或NK细胞。利用本文中所提供的方法生产的和/或在本文中所提供的方法中使用的经转导和/或遗传修饰的T细胞和/或NK细胞包括在经由逆转录病毒(例如慢病毒)颗粒自逆转录病毒(例如慢病毒)基因组递送的说明性实施方式中为此类细胞及为利用这类细胞方法(例如过继性细胞疗法)提供经改良特征的功能性及功能性组合。举例而言，这样的细胞可以在更短的时间内离体生产，并且具有可以被更好地调节的改善的生长特性。本文在一些方面中提供了用于调节CAR的表达的调节元件，mRNA，抑制性RNA和/或在淋巴细胞(如T细胞及NK细胞)中非抑制性RNA的淋巴增殖性元件(lymphoproliferativeelement)。此外，本文在一些方面中提供表达多种功能元件并在其表面上携载多种功能元件的重组逆转录病毒，以及用于生产重组逆转录病毒的方法及包装细胞系。这些重组逆转录病毒及用于生产它们的方法和细胞克服了现有技术对于基因组中在递送至T细胞和/或NK细胞时提供益处的不同功能元件的数目和大小的限制。在一些方面中，提供用于转导和/或遗传修饰淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的方法，并且在说明性实施方式中，提供用于转导和/或遗传修饰静息T细胞和/或NK细胞的离体方法。这些方面中的一些可比先前方法快速得多地执行，这样可以促进改进患者护理方法。此外，本文中提供在一些实施方式中利用本文提供的重组逆转录病毒在一些方面中连同药剂以提供改进的安全机制以帮助调节经转导和/或遗传修饰的淋巴细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的活性的方法。这些方法，组合物及试剂盒可用于用表达CAR的经转导和/或遗传修饰的T细胞和/或NK细胞的过继性细胞疗法。在本专利申请中提供了关于本公开内容的方面和实施方式的更多细节。章节及章节标题并不旨在限制其中方法，组合物及试剂盒或功能元件的组合。附图简述图1显示包括包装细胞(100)及本公开的一个例示性，非限制性实施方式的包装细胞(100)产生的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒(200)的说明性组合物的示意图。在图1中，能够编码本专利技术方面的多种载体(被称为重组多核苷酸(110))被包装至重组逆转录病毒颗粒(200)中，该重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包括第一经改造信号传导多肽(其包括一个或多个淋巴增殖性元件)及在一些实施方式中第二经改造信号传导多肽(其为嵌合抗原受体或CAR)。复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒在其膜上表达：允许复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒与靶细胞结合并融合的假型化元件(pseudotypingelement)(在一非限制性实施方式中，麻疹病毒凝血素(H)多肽及麻疹病毒融合(F)多肽，或其细胞质结构域缺失变体)(240)；能够结合并活化静息T细胞的活化元件(在非限制性实施方式中，具有能够结合CD28的多肽及能够结合CD3的多肽的活化元件(分别为210及220)；及膜结合细胞因子(在一非限制性实施方式中，IL-7DAF融合多肽)(230)。标记为(250)，(260)，(270)，(280)及(290)的部分分别为Src-FLAG-Vpx，HIVgag基质，HIVgag衣壳，RNA及HIVpol。图2显示包括由包装细胞(100)产生的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒(200)及由复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒(200)转染的静息T细胞(300)的说明性组合物的示意性图。复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒(200)表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其包含逆转录病毒基因组，所述逆转录病毒基因组包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子的一个或更多个核酸序列，其中：A.所述一个或更多个核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或更多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，以及B.所述一个或更多个核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜结构域和胞内活化结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.08 US 62/360,041;2017.03.03 US 62/467,039;1.一种复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其包含逆转录病毒基因组，所述逆转录病毒基因组包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子的一个或更多个核酸序列，其中：A.所述一个或更多个核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或更多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，以及B.所述一个或更多个核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜结构域和胞内活化结构域。2.根据权利要求1的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述逆转录病毒基因组包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增殖性元件。3.根据权利要求2的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述至少一种淋巴增殖性元件是组成型活化的IL-7受体。4.根据权利要求1、2和3中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的每一个包含彼此部分或完全互补的5’链和3’链，其中所述5’链和所述3’链能够形成18-25个核苷酸的RNA双链体。5.根据权利要求4的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述抑制性RNA分子是miRNA或shRNA。6.根据权利要求1、2、3、4和5中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子以顺次排列的形式位于所述第一核酸序列中。7.根据权利要求1、2、3、4、5和6中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子针对不同的RNA靶标。8.根据权利要求1、2、3、4、5、6和7中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述第一核酸序列编码2至10个抑制性RNA分子。9.根据权利要求1、2、3、4、5、6和7中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述第一核酸序列编码2至4个抑制性RNA分子。10.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8和9中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述第一核酸序列位于内含子中。11.根据权利要求10的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述内含子在启动子中。12.根据权利要求10的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述内含子与启动子相邻且在所述启动子下游，以及其中所述启动子在用于生产所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒的包装细胞中是无活性的。13.根据权利要求10的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述内含子是EF1-α内含子A。14.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个自5’至3’方向包含：5’臂、5’茎、环、与所述5’茎部分或完全互补的3’茎，以及3’臂。15.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中每个所述抑制性RNA分子自5’至3’方向包含：5’臂、5’茎、环、与所述5’茎部分或完全互补的3’茎，以及3’臂。16.根据权利要求14或15的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述5’茎的长度为18至25个核苷酸。17.根据权利要求14或15的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述3’茎的长度为18至25个核苷酸。18.根据权利要求14或15的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述环的长度为3至40个核苷酸。19.根据权利要求14或15的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自天然存在的miRNA。20.根据权利要求19的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自天然存在的miRNA，所述天然存在的miRNA选自：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122和miR-21。21.根据权利要求19的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自miR-155。22.根据权利要求21的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述5’microRNA臂、所述3’臂或它们二者源自小家鼠(Musmusculus)miR-155。23.根据权利要求22的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述5’臂具有SEQIDNO:256中所示序列。24.根据权利要求22的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述3’臂具有SEQIDNO:260中所示序列。25.根据权利要求22的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述3’臂包含小家鼠(Musmusculus)BIC的第221-283位核苷酸。26.根据权利要求21的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自人(Homosapiens)miR-155。27.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个降低内源性TCR的表达。28.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的每个降低内源性TCR的表达。29.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述RNA靶标是从选自以下的基因转录的mRNA：PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A和ABCG1。30.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述RNA靶标是从TCRα基因转录的mRNA。31.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个是miR-155。32.根据权利要求1至31中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒还包含在其表面上的假型化元件，所述假型化元件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒与所述T细胞和/或NK细胞的膜融合。33.根据权利要求1至32中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述CAR为微环境限制的生物(MRB)-CAR。34.根据权利要求1至33中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述CAR的ASTR与肿瘤相关抗原结合。35.根据权利要求1至34中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒在其表面上包含活化元件，所述活化元件包含：A.能够与CD3结合的膜结合多肽；和/或B.能够与CD28结合的膜结合多肽，以及其中所述能够与CD3结合的膜结合多肽与异源性GPI锚连接序列融合，以及所述能够与CD28结合的膜结合多肽与异源性GPI锚连接序列融合。36.根据权利要求35的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述能够与CD3结合的膜结合多肽是抗-CD3scFV或抗-CD3scFvFc。37.根据权利要求35的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述能够与CD3结合的膜结合多肽是抗-CD3scFvFc。38.根据权利要求1至37中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述第一核酸序列可操作地连接至核糖开关。39.根据权利要求38的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述核糖开关能够结合核苷类似物。40.根据权利要求39的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述核苷类似物是抗病毒药物。41.根据权利要求1至40中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒包含在其表面上的编码结构域的核酸，所述结构域被单克隆抗体经批准的生物物质所识别。42.根据权利要求1至41中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒包含在其表面上的一个或更多个假型化元件，所述假型化元件选自：麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽、VSV-G多肽，以及保留与静息T细胞和/或静息NK细胞结合的能力的任何其片段。43.根据权利要求1至41中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒包含在其表面上的VSV-G多肽。44.根据权利要求4的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子包含miRNA的前体。45.一种哺乳动物包装细胞系，其包含复制缺陷型逆转录病毒颗粒的可包装的RNA基因组，其中所述可包装的RNA基因组包含：A.5’长末端重复或其活性片段；B.编码逆转录病毒顺式作用RNA包装元件的核酸序列；C.多核苷酸，其包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子的一个或更多个核酸序列，其中所述一个或更多个核酸的第一核酸序列编码针对一个或更多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，且所述一个或更多个核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜结构域和胞内活化结构域；以及D.3’长末端重复或其活性片段。46.根据权利要求45的哺乳动物包装细胞系，其中所述多核苷酸包含所述一个或更多个核酸序列的第三核酸序列，所述第三核酸序列编码不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增殖性元件。47.根据权利要求45或46的哺乳动物包装细胞系，其中包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子的一个或更多个核酸序列的所述多核苷酸与编码逆转录病毒顺式作用RNA包装元件、5’长末端重复和/或3’长末端重复的核酸序列呈相反方向。48.根据权利要求45、46和47中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述可包装的RNA基因组的表达由在所述哺乳动物包装细胞系中有活性的诱导型启动子驱动。49.根据权利要求45、46、47和48中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述逆转录病毒顺式作用RNA包装元件包含中央聚嘌呤区(cPPT)/中央终止序列、HIVPsi，或其组合。50.根据权利要求46的哺乳动物包装细胞系，其中所述至少一种淋巴增殖性元件是组成型活化的IL-7受体。51.根据权利要求45至50中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的每一个包含彼此部分或完全互补的5’链和3’链，其中所述5’链和所述3’链形成18-25个核苷酸的RNA双链体。52.根据权利要求51的哺乳动物包装细胞系，其中所述抑制性RNA分子是miRNA或shRNA。53.根据权利要求45至52中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子以顺次排列的形式位于所述第一核酸序列中。54.根据权利要求45至53中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子针对相同或不同的RNA靶标。55.根据权利要求45至54中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述第一核酸序列编码2至10个抑制性RNA分子。56.根据权利要求45至54中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述第一核酸序列编码2至4个抑制性RNA分子。57.根据权利要求45至56中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述第一核酸序列位于内含子中。58.根据权利要求57的哺乳动物包装细胞系，其中所述内含子在启动子中。59.根据权利要求57的哺乳动物包装细胞系，其中所述内含子与启动子相邻且在所述启动子下游，其中所述启动子在包装细胞中是无活性的。60.根据权利要求57的哺乳动物包装细胞系，其中所述内含子是EF1-α内含子A。61.根据权利要求45至60中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个自5’至3’方向包含：5’臂、5’茎、环、与所述5’茎部分或完全互补的3’茎，以及3’臂。62.根据权利要求45至60中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中每个所述抑制性RNA分子自5’至3’方向包含：5’臂、5’茎、环、与所述5’茎部分或完全互补的3’茎，以及3’臂。63.根据权利要求61或62的哺乳动物包装细胞系，其中所述5’茎的长度为18至25个核苷酸。64.根据权利要求61或62的哺乳动物包装细胞系，其中所述3’茎的长度为18至25个核苷酸。65.根据权利要求61或62的哺乳动物包装细胞系，其中所述环的长度为3至40个核苷酸。66.根据权利要求61或62的哺乳动物包装细胞系，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自天然存在的miRNA。67.根据权利要求66的哺乳动物包装细胞系，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自天然存在的miRNA，所述天然存在的miRNA选自：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122和miR-21。68.根据权利要求66的哺乳动物包装细胞系，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自miR-155。69.根据权利要求68的哺乳动物包装细胞系，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自小家鼠(Musmusculus)miR-155。70.根据权利要求69的哺乳动物包装细胞系，其中所述5’臂具有SEQIDNO:256中所示序列。71.根据权利要求69的哺乳动物包装细胞系，其中所述3’臂具有SEQIDNO:260中所示序列。72.根据权利要求69的哺乳动物包装细胞系，其中miR-155的所述3’臂包含小家鼠(Musmusculus)BIC的第221-283位核苷酸。73.根据权利要求68的哺乳动物包装细胞系，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自人(Homosapiens)miR-155。74.根据权利要求45至73中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个降低TCR的表达。75.根据权利要求45至73中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的每个降低TCR的表达。76.根据权利要求45至73中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述RNA靶标是从选自以下的基因转录的mRNA：PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A和ABCG1。77.根据权利要求45至73中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述RNA靶标是从TCRα基因转录的mRNA。78.根据权利要求45至62中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个是miR-155。79.根据权利要求45至78中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述CAR为微环境限制的生物(MRB)-CAR。80.根据权利要求45至79中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述CAR的ASTR与肿瘤相关抗原结合。81.根据权利要求45至80中任一项的哺乳动物包装细胞系，其中所述第一核酸序列可操作地连接至核糖开关。82.根据权利要求81的哺乳动物包装细胞系，其中所述核糖开关能够结合核苷类似物。83.根据权利要求82的哺乳动物包装细胞系，其中所述核苷类似物是抗病毒药物。84.根据权利要求83的哺乳动物包装细胞系，其中所述抗病毒药物是阿昔洛韦或喷昔洛韦。85.一种用于遗传修饰受试者的淋巴细胞的方法，其包括使受试者的T细胞和/或NK细胞在离体的情况下与复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒接触，所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子的一个或更多个核酸序列，其中所述一个或更多个核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或更多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，且所述一个或更多个核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜结构域和胞内活化结构域，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。86.根据权利要求85的方法，其还包括将所述遗传修饰的T细胞和/或NK细胞引入所述受试者。87.根据权利要求85或86的方法，其中所述多核苷酸包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增殖性元件。88.根据权利要求87的方法，其中所述至少一种淋巴增殖性元件是组成型活化的IL-7受体。89.根据权利要求85至88中任一项的方法，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的每一个包含彼此部分或完全互补的5’链和3’链，其中所述5’链和所述3’链形成18-25个核苷酸的RNA双链体。90.根据权利要求89的方法，其中所述抑制性RNA分子是miRNA或shRNA。91.根据权利要求85至90中任一项的方法，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子以顺次排列的形式位于所述第一核酸序列中。92.根据权利要求85至91中任一项的方法，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子针对相同或不同的RNA靶标。93.根据权利要求85至92中任一项的方法，其中所述第一核酸序列编码2至10个抑制性RNA分子。94.根据权利要求85至92中任一项的方法，其中所述第一核酸序列编码2至4个抑制性RNA分子。95.根据权利要求85至94中任一项的方法，其中所述第一核酸序列位于内含子中。96.根据权利要求95的方法，其中所述内含子在启动子中。97.根据权利要求95的方法，其中所述内含子与启动子相邻且在所述启动子下游，其中所述启动子在包装细胞中是无活性的。98.根据权利要求95的方法，其中所述内含子是EF1-α内含子A。99.根据权利要求85至98中任一项的方法，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个自5’至3’方向包含：5’臂、5’茎、环、与所述5’茎部分或完全互补的3’茎，以及3’臂。100.根据权利要求85至98中任一项的方法，其中每个所述抑制性RNA分子自5’至3’方向包含：5’臂、5’茎、环、与所述5’茎部分或完全互补的3’茎，以及3’臂。101.根据权利要求99或100的方法，其中所述5’茎的长度为18至25个核苷酸。102.根据权利要求99或100的方法，其中所述3’茎的长度为18至25个核苷酸。103.根据权利要求99或100的方法，其中所述环的长度为3至40个核苷酸。104.根据权利要求99或100的方法，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自天然存在的miRNA。105.根据权利要求104的方法，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自天然存在的miRNA，所述天然存在的miRNA选自：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122和miR-21。106.根据权利要求104的方法，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自miR-155。107.根据权利要求106的方法，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自小家鼠(Musmusculus)miR-155。108.根据权利要求107的方法，其中所述5’臂具有SEQIDNO:256中所示序列。109.根据权利要求107的方法，其中所述3’臂具有SEQIDNO:260中所示序列。110.根据权利要求107的方法，其中miR-155的所述3’臂包含小家鼠(Musmusculus)BIC的第221-283位核苷酸。111.根据权利要求106的方法，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自人(Homosapiens)miR-155。112.根据权利要求85至111中任一项所述的方法，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个降低TCR的表达。113.根据权利要求85至111中任一项的方法，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的每个降低TCR的表达。114.根据权利要求85至111中任一项的方法，其中所述RNA靶标是从选自以下的基因转录的mRNA：PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A和ABCG1。115.根据权利要求85至111中任一项的方法，其中所述RNA靶标是从TCRα基因转录的mRNA。116.根据权利要求85至103中任一项的方法，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个是miR-155。117.根据权利要求85至116中任一项的方法，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒还包含在其表面上的假型化元件，所述假型化元件能够与T细胞和/或NK细胞结合且有助于所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒与所述T细胞和/或NK细胞的膜融合。118.根据权利要求85至117中任一项的方法，其中所述CAR为微环境限制的生物(MRB)-CAR。119.根据权利要求85至118中任一项的方法，其中所述CAR的ASTR与肿瘤相关抗原结合。120.根据权利要求85至118中任一项的方法，其中所述CAR的ASTR为微环境限制的生物(MRB)-ASTR。121.根据权利要求85至120中任一项的方法，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒在其表面上包含活化元件，所述活化元件包含：A.能够与CD3结合的膜结合多肽；和/或B.能够与CD28结合的膜结合多肽，以及其中所述能够与CD3结合的膜结合多肽与异源性GPI锚连接序列融合，以及所述能够与CD28结合的膜结合多肽与异源性GPI锚连接序列融合。122.根据权利要求121的方法，其中所述能够与CD3结合的膜结合多肽是与CD14GPI锚连接序列结合的抗-CD3scFV或抗-CD3scFvFc，以及其中所述能够与CD28结合的膜结合多肽是与CD16BGPI锚连接序列结合的CD80或其胞外结构域。123.根据权利要求121的方法，其中所述能够与CD3结合的膜结合多肽是抗-CD3scFvFc。124.根据权利要求85至123中任一项的方法，其中所述第一核酸序列可操作地连接至核糖开关。125.根据权利要求124的方法，其中所述核糖开关能够结合核苷类似物。126.根据权利要求125的方法，其中所述核苷类似物是抗病毒药物。127.根据权利要求126的方法，其中所述抗病毒药物是阿昔洛韦或喷昔洛韦。128.根据权利要求85至127中任一项的方法，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒包含在其表面上的一个或更多个假型化元件，所述假型化元件选自：麻疹病毒F多肽、麻疹病毒H多肽、VSV-G多肽，以及保留与静息T细胞和/或静息NK细胞结合的能力的任何其片段。129.根据权利要求85至127中任一项的方法，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒包含在其表面上的VSV-G多肽。130.根据权利要求85至129中任一项的方法，其中所述遗传修饰的T细胞和/或NK细胞在被引入或重新引入受试者之前在离体的情况下经历4次或更少次的细胞分裂。131.根据权利要求85至130中任一项的方法，其中所述静息T细胞和/或静息NK细胞与所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒接触1小时至12小时之间。132.根据权利要求85至131中任一项的方法，其中从所述受试者收集血液的时间与将所述遗传修饰的T细胞和/或NK细胞重新引入受试者的时间之间经过不超过8小时。133.根据权利要求85至132中任一项的方法，其中收集血液之后和重新引入血液之前的所有步骤在封闭系统中进行，其中在整个过程中有人监控所述封闭系统。134.根据权利要求85至133中任一项的方法，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒的基因组编码可检测标记，以及在转导后在所述T细胞和/或NK细胞中检测所述可检测标记。135.一种遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其包含：A.针对一个或更多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子；和B.嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜结构域和胞内活化结构域，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子和所述CAR由作为所述T细胞和/或NK细胞的遗传修饰的核酸序列编码。136.根据权利要求135的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述遗传修饰的T细胞和/或NK细胞还包含不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增殖性元件，以及其中所述淋巴增殖性元件由作为所述T细胞和/或NK细胞的遗传修饰的核酸序列编码。137.根据权利要求135或136的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述至少一种淋巴增殖性元件是组成型活化的IL-7受体。138.根据权利要求135至137中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述抑制性RNA分子是miRNA或shRNA。139.根据权利要求135至138中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子是多顺反子的。140.根据权利要求135至139中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子针对不同的RNA靶标。141.根据权利要求135至140中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个降低内源性TCR的表达。142.根据权利要求135至140中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的每个降低内源性TCR的表达。143.根据权利要求135至140中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述RNA靶标是从选自以下的基因转录的mRNA：PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A和ABCG1。144.根据权利要求135至140中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述RNA靶标是从TCRα基因转录的mRNA。145.根据权利要求135至140中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个是miR-155。146.根据权利要求135至145中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述CAR为微环境限制的生物(MRB)-CAR。147.根据权利要求135至146中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述CAR的ASTR与肿瘤相关抗原结合。148.根据权利要求135至147中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述第一核酸序列可操作地连接至核糖开关。149.根据权利要求148的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述核糖开关能够结合核苷类似物。150.根据权利要求149的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述核苷类似物是抗病毒药物。151.根据权利要求135至137和139至150中任一项的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述抑制性RNA分子是miRNA的前体。152.一种在用于遗传修饰受试者的淋巴细胞的方法中使用以治疗肿瘤生长的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子的一个或更多个核酸序列，其中所述一个或更多个核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或更多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，以及所述一个或更多个核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜结构域和胞内活化结构域，其中所述方法包括在离体的情况下接触所述受试者的T细胞和/或NK细胞，以及所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。153.一种在根据权利要求152的方法中使用的药剂，其中所述方法还包括将遗传改造的T细胞和/或NK细胞引入所述受试者中。154.一种在用于遗传修饰受试者的T细胞和/或NK细胞的方法中使用以治疗肿瘤生长的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述方法包括：A.使所述受试者的T细胞和/或NK细胞在离体的情况下与复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒接触，所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子的一个或更多个核酸序列，其中所述一个或更多个核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或更多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，且所述一个或更多个核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜结构域和胞内活化结构域，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞；以及B.将所述遗传修饰的T细胞和/或NK细胞引入所述受试者中，从而遗传修饰所述受试者的T细胞和/或NK细胞。155.在根据权利要求154的方法中使用的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中T细胞和/或NK细胞的群体在接触步骤中被接触，并且在引入步骤中被引入所述受试者中。156.一种复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒在制备用于遗传修饰受试者的T细胞和/或NK细胞的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒的使用包括：A.使所述受试者的T细胞和/或NK细胞在离体的情况下与复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒接触，所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子的一个或更多个核酸序列，其中所述一个或更多个核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或更多个靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，且所述一个或更多个核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜结构域和胞内活化结构域，其中所述接触有助于利用所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒转导静息T细胞和/或NK细胞中的至少一些，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞；以及B.将所述遗传修饰的T细胞和/或NK细胞引入所述受试者中，从而遗传修饰所述受试者的T细胞和/或NK细胞。157.根据权利要求152至156中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的每一个包含彼此部分或完全互补的5’链和3’链，其中所述5’链和所述3’链能够形成18-25个核苷酸的RNA双链体。158.根据权利要求152至157中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述抑制性RNA分子是miRNA或shRNA。159.根据权利要求152至158中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子以顺次排列的形式位于所述第一核酸序列中。160.根据权利要求152至159中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述第一核酸序列编码2至6个抑制性RNA分子。161.根据权利要求152至160中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述第一核酸序列位于内含子中。162.根据权利要求152至161中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中每个所述抑制性RNA分子自5’至3’方向包含：5’臂、5’茎、环、与所述5’茎部分或完全互补的3’茎，以及3’臂。163.根据权利要求162的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述5’茎和所述3’茎的长度各为18至25个核苷酸。164.根据权利要求162或163的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述5’臂、所述3’臂或它们二者源自天然存在的miRNA，所述天然存在的miRNA选自：miR-155、miR-30、miR-17-92、miR-122和miR-21。165.根据权利要求152至164中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述两个或更多个抑制性RNA分子中的至少一个降低内源性TCR的表达。166.根据权利要求152至164中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述RNA靶标是从选自以下的基因转录的mRNA：PD-1、CTLA4、TCRα、TCRβ、CD3ζ、SOCS、SMAD2、miR-155靶标、IFNγ、cCBL、TRAIL2、PP2A和ABCG1。167.根据权利要求152至166中任一项的复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒，其中所述多核苷酸包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码不为抑制性RNA分子的至少一种淋巴增殖性元件。168.一种商业化容器，其含有复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒和使用所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒治疗受试者中的肿瘤生长的说明书，其中所述复制缺陷型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含可操作地连接至在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子的一个或更多个核酸序列，其中所述一个或更多个核酸序列的第一核酸序列编码针对一个或更多个RNA靶标的两个或更多个抑制性RNA分子，且所述一个或更多个核酸序列的第二核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷戈里·伊恩·弗罗斯特，吉亚贝·H·古比加，詹姆斯·约瑟夫·奥努弗，法扎德·哈里扎德，
申请(专利权)人：F一肿瘤医学公司，
类型：发明
国别省市：美国,US