抗B7-H4抗体制造技术

本发明专利技术的课题是制作具有高特异性·亲和性的新型抗B7‑H4抗体，并提供利用了该新型抗B7‑H4抗体的癌症治疗用组合物，新制作了特异性结合于人B7‑H4蛋白质的胞外域蛋白的单克隆抗体，此外，为了增强该单克隆抗体的抗体依赖性细胞毒活性，制作了使该单克隆抗体与效应细胞结合而成的“抗B7‑H4抗体‑效应细胞复合体”、包含该单克隆抗体的抗原识别区域和效应细胞抗原识别区域的双特异性抗体，将它们作为癌症治疗用组合物使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗B7-H4抗体
本专利技术涉及识别人B7-H4蛋白质的胞外域的抗体、上述抗体与效应细胞结合而成的连接抗体-细胞复合体、包含上述抗体的重链可变区及轻链可变区的双特异性抗体等。
技术介绍
B7-H4为属于B7家族的膜蛋白，作为免疫检查点分子为人所知(非专利文献1)。已明确报道在肺、肝脏、卵巢等各种正常组织中观察到了B7-H4mRNA的低水平表达，但并未确认到B7-H4蛋白质在这些正常组织中的表达。另一方面，已知B7-H4蛋白质在卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌等各种癌组织中均高表达而与阶段无关(非专利文献2)。因此，B7-H4作为新型的癌症分子标志物、癌症治疗的靶分子而受到期待，但关于B7-H4的表达及其作用，仍留有很多尚未明确的问题。随着近年来抗体工程的发展，能够制作人嵌合抗体、人源化抗体这样的相对于人的抗原性低且可临床应用的基因重组抗体，因此，尤其是以癌症治疗领域为中心逐渐开发·批准了抗体药物。作为药物所开发的抗体基本上为分子量约150kDa的人IgG，是在其Fc区域上结合了2条N-糖苷键复合型糖链的糖蛋白。Fc区域为Fc受体、补体等结合的区域，认为通过该部分可发挥抗体依赖性细胞毒活性(antibody-dependentcellularcytotoxicity；ADCC)、补体依赖性细胞毒活性(complement-dependentcytotoxicity；CDC)等效应活性。实际上，由癌症患者Fc受体的多型解析表明，非霍奇金淋巴瘤治疗药抗CD20抗体Rituxan(R)(利妥昔单抗)、乳腺癌治疗药抗Her2抗体Herceptin(R)(曲妥珠单抗)的主要抗肿瘤机制之一为ADCC活性(非专利文献3-7)，在医药开发中可应用的ADCC活性增强技术的开发作为下一代抗体技术而受到关注。作为特异性识别B7-H4的抗体，已经公开了几种单克隆抗体(例如专利文献1及2)。尤其是，专利文献1公开了在体外相对于表达B7-H4的癌细胞发挥ADCC活性的抗B7-H4抗体，但该抗体在体内发挥ADCC活性的可能性并不明确。另外，专利文献1公开了包含上述抗B7-H4抗体或其片段的双特异性分子，作为具体例，记载了识别B7-H4和Fc受体的双特异性分子、及通过该双特异性分子可使B7-H4表达细胞朝向效应细胞并诱导介由Fc受体的效应细胞活性(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用等)的可能性，但其效果实际上并未确认。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2011-505372号公报专利文献2：日本特表2016-509582号公报非专利文献非专利文献1：Immunity,18,849(2003)非专利文献2：GynecolOncol.,134,181(2014)非专利文献3：Blood99,754(2002)非专利文献4：CancerRes.,64,4664(2004)非专利文献5：ArthritisRheum.,48,455(2003)非专利文献6：J.Clin.Oncol.,21,3940(2003)非专利文献7：Clin.CancerRes.,10,5650(2004)
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术的课题在于制作具有高特异性·亲和性的新型抗B7-H4抗体，进而制作使该抗体的ADCC活性增强的“连接抗体-细胞复合体”、“双特异性抗体”等，由此提供有效的癌症治疗用组合物。用于解决课题的手段本申请的专利技术人将人B7-H4蛋白质的胞外域蛋白作为抗原对小鼠进行免疫，制作了可产生具有与B7-H4结合的能力的抗体的多个杂交瘤株。然后，通过ELISA法及夹心ELISA(sandwichELISA)法，从来自所得到的杂交瘤株的抗体中选出了8种相对于游离型B7-H4具有高特异性和亲和性的抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.140、H4.160及H4.209)，进而，通过使用了使B7-H4蛋白质一过性地过量表达的培养细胞的免疫染色实验，明确了上述抗B7-H4抗体中至少H4.018、H4.025、H4.113、H4.121及H4.209可识别在细胞表面上表达的B7-H4。接着，本申请的专利技术人使用上述抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.113、H4.209)，进行了表达人B7-H4蛋白质的培养癌细胞的免疫染色。然而，所得到的结果表明实验中使用的任意抗B7-H4抗体均无法保证与癌细胞稳定的结合。因此，本申请的专利技术人认为，为了治疗癌症而单独使用上述抗B7-H4抗体时，无法发挥充分的ADCC活性。因此，本申请的专利技术人深入研究了增强上述抗B7-H4抗体的ADCC活性的方法，想出了若使上述抗B7-H4抗体与效应细胞预先结合来作用于靶细胞则能够诱导间接性的抗体依赖性细胞毒活性(indirectADCC；iADCC)这样的独创性构思，实际制作了“抗B7-H4抗体-效应细胞复合体”，并确认了其效果。即，本申请的专利技术人依次使抗CD3抗体、兔抗小鼠免疫球蛋白多克隆抗体及抗B7-H4抗体(H4.018、H4.025、H4.113或H4.209)结合于从人外周血分离的效应细胞，制作了4种抗B7-H4抗体-效应细胞复合体(抗B7-H4抗体-效应细胞复合体、H4.018-效应细胞复合体、H4.025-效应细胞复合体、H4.113-效应细胞复合体及H4.209-效应细胞复合体)，并使用这些抗B7-H4抗体-效应细胞复合体进行了细胞毒性测定，结果表明至少H4.025-效应细胞复合体相对于靶标癌细胞可发挥细胞毒活性。本申请的专利技术人还解析了上述抗B7-H4抗体中的7种抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.113、H4.121、H4.140及H4.209)的重链及轻链可变区的氨基酸序列及基因序列，基于所得到的序列信息，制作了2种识别B7-H4和CD3抗原(T细胞抗原)这两者的双特异性抗体(scFv-scFv及Fab-scFv)，在体外及体内对它们的效果进行了确认。结果表明，上述scFv-scFv及Fab-scFv相对于表达B7-H4的癌细胞均显示出浓度依赖性的细胞毒活性，另外，明确了向患癌小鼠施予上述Fab-scFv时可观察到肿瘤尺寸的缩小、Fab-scFv在肿瘤组织内的积聚及CD8阳性杀伤性T细胞的浸润、肿瘤组织中的B7-H4阳性的癌细胞的减少·消亡等优异的抗肿瘤作用，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及(1)识别人B7-H4蛋白质的胞外域的抗体，其包含以下(a)～(g)中的任一个区域：(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区；(f)包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗体，其识别人B7‑H4蛋白质的胞外域，并包含以下(a)～(g)中的任一个区域，(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区；(f)包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区；(g)包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.26 JP 2016-1459021.抗体，其识别人B7-H4蛋白质的胞外域，并包含以下(a)～(g)中的任一个区域，(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区；(f)包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区；(g)包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区。2.核酸，其编码识别人B7-H4蛋白质的胞外域的抗体，并包含以下(A’)～(G’)中的任一个核酸序列，(A’)编码包含序列号2所示的氨基酸序列的重链可变区的核酸序列；(B’)编码包含序列号4所示的氨基酸序列或序列号4的第3位～第111位所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号6所示的氨基酸序列或序列号6的第4位～第104位所示的氨基酸序列或者序列号8所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(C’)编码包含序列号10所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号12所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(D’)编码包含序列号14所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号16或18所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(E’)编码包含序列号20所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号22所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(F’)编码包含序列号24所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号26所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列；(G’)编码包含序列号28所示的氨基酸序列的重链可变区、及包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列。3.如权利要求2所述的核酸，其包含以下(A)～(G)中的任一个核酸序列，(A)序列号1所示的核酸序列；(B)序列号3所示的核酸序列或序列号38的第64位～第390位所示的核酸序列、及序列号5所示的核酸序列或序列号36的第76位～第378位所示的核酸序列或者序列号7所示的核酸序列；(C)序列号9所示的核酸序列、及序列号11所示的核酸序列；(D)序列号13所示的核酸序列、及序列号15或17所示的核酸序列；(E)序列号19所示的核酸序列、及序列号21所示的核酸序列；(F)序列号23所示的核酸序列、及序列号25所示的核酸序列；(G)序列号27所示的核酸序列、及序列号29所示的核酸序列。4.载体，其含有权利要求2或3所述的核酸。5.转化体，其是将权利要求4所述的载体导入宿主细胞而得到的。6.如权利要求1所述的抗体，其为单克隆抗体。7.杂交瘤，其产生权利要求6所述的抗体。8.癌细胞检测用试剂盒，其具备权利要求1或6所述的抗体。9.抗体连接体，其是由权利要求1或6所述的抗体形成的第一抗体与识别效应细胞抗原的第二抗体结合而成的。10.如权利要求9所述的抗体连接体，其中，第二抗体为识别CD3抗原的抗体。11.癌症治疗用组合物，其包含权利要求9或10所述的抗体连接体，通过所述抗体连接体将效应细胞送达至癌细胞。12.连接抗体-细胞复合体，其是效应细胞结合于抗体连接体而成的，所述抗体连接体是由权利要求1或6所述的抗体形成的第一抗体与识别效应细胞抗原的第二抗体结合而成的。13.如权利要求12所述的连接抗体-细胞复合体，其中，第一抗体和第二抗体介由识别所述第一抗体及所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：秋山靖人，饭塚明，
申请(专利权)人：静冈县，
类型：发明
国别省市：日本,JP