多能干细胞分化成肠中肠内胚层细胞制造技术

本发明专利技术公开了肠中肠内胚层细胞群和生成表达肠内胚层谱系的标记特征的细胞的方法。还公开了治疗病症诸如糖尿病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多能干细胞分化成肠中肠内胚层细胞
本专利技术涉及一种基于细胞的治疗病症诸如糖尿病的领域。具体地，本专利技术涉及细胞分化，包括引导人多能干细胞分化，以生成肠中肠内胚层细胞群。本专利技术提供细胞或细胞群以及产生用于表达肠中肠内胚层的标记特征的细胞的方法。
技术介绍
关于肠促胰岛素激素作用机制的知识的进展以及在干细胞阶段和内分泌细胞阶段两者处对肠分化的理解的进步已引起对开发适于植入的肠促胰岛素激素产生细胞的来源的兴趣。一种方法是从多能干细胞诸如人胚胎干细胞(“hESC”)或经诱导的多能干细胞(“iPS”)产生功能性肠内分泌L或K细胞。来自肠L细胞的胰高血糖素类肽1(GLP-1)或来自肠K细胞的葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)的产生/分泌对糖尿病的治疗具有有益效果。肠促胰岛素对糖尿病(第1型和第2型)的治疗具有系统性效果(Unger，J.,CurrDiabRep.,2013；13(5):663-668)。有益效果可包括扩增以下许多方面：beta(β)细胞功能和数量、抑制胰高血糖素分泌、提高周边代谢组织的胰岛素敏感性、减少肝脏糖异生，以及减少食欲。已鉴定两类基于肠促胰岛素的治疗剂用于治疗糖尿病(GLP-1受体激动剂和二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂)。然而，目前没有基于肠促胰岛素的细胞治疗方案，其将涵盖用于改善的和有效的基于GLP1的糖尿病治疗的内源和细胞指示物。此外，目前的基于肠促胰岛素的疗法不受循环血糖水平的调节，并且因此提供非生理调节的GLP产生。在脊椎动物胚胎发育中，多能细胞可在被称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。间充质组织来源于中胚层并且尤其由经表达的1(HAND1)的基因心脏和神经嵴衍生物以及叉头框F1(FOXF1)标记。组织(诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏)将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段为形成定形内胚层。到原肠胚形成为止，内胚层划被分成可通过对一组因子的表达来识别的前-后域，该一组因子唯一地标记内胚层的前前肠、后前场、中肠和后场区。对特定转录因子(“TF”)的表达的水平可用于指定组织的身份，如Grapin-Botten等人，趋势遗传学(TrendsGenet)，2000；16(3):124-130中所述的。FOXA2标记沿前后轴的整个内胚层。在定形内胚层转化成原肠管期间，肠管变得被分区成广泛的域，该广泛的域可通过限制性基因表达模式在分子水平上进行观察。前前肠通过对SOX2的高表达大致标记，并且涵盖器官域，诸如甲状腺，肺和食道。中肠(包括十二指肠、回肠、空肠)和后肠(包括结肠)通过对尾型同源盒2(CDX2)的高表达来标记。SOX2-CDX2边界出现在中后部前肠内，附加TF在该中后部前肠内标记特定器官域。后前场内的经分区的胰腺域显示出对PDX1的极高表达，但对CDX2和SOX2的表达极低。PTF1A在胰腺组织中被高度表达。低PDX1表达连同高CDX2表达标记十二指肠域。由特定同源盒(HOX)基因对肠内胚层进行图案化。例如，HOXC5在中肠内胚层细胞中优先表达。此外，对HOXA13和HOXD13的表达被限制于后肠内胚层细胞。ALB基因或白蛋白1蛋白标记后前肠内胚层中的最早的肝脏祖细胞(Zaret等人，发育生物学的当前主题(CurrTopDevbiol)，2016；117:647-669)。在改善从人多能干细胞生成肠内胚层细胞的协议方面已取得了进展。例如，以下出版物(Spence等人，自然(nature)，2011；470(7332):105-109；Watson等人，自然医学(NatureMedicine)，2014；20(11):1310-1314；和Kauffman等人，前药理学(FrontPharmacol)，2013；4(79)：1-18)概述了使用成纤维细胞生长因子(FGF)-4、无翅型MMTV整合位族、成员3A(WNT3A)、Chiron99021或视黄酸(RA)和起始于定形内胚层阶段(在此阶段生成中/后肠球状体)的FGF7的分化协议，其不仅包含CDX2+/FOXA2+内胚层群，而且还包含显著的间充质CDX2+细胞群。来自这些hESC衍生的中/后肠球体的肠内分泌细胞分化的过程非常低效，需要长时间段，并且无差别地指向所有肠细胞类型的绒毛间和绒毛区域的生成。仍需要技术来生成肠中肠内胚层细胞，而不会显著污染间充质，从而能够产生用于细胞治疗剂的高效率肠内分泌细胞。
技术实现思路
如所体现和完全描述的，本专利技术提供细胞、细胞群和通过分化人多能干细胞而生成细胞的方法。具体地，本专利技术的特征在于使人多能干细胞直接分化以生成肠中肠内胚层细胞，更具体地生成肠中肠内胚层细胞的内胚层单层的方法。本专利技术的一个方面是产生肠中肠内胚层细胞群的方法，包括在培养基中培养人多能干细胞。在实施方案中，该方法包括诱导人多能干细胞向肠中肠内胚层细胞的分化。在一些实施方案中，产生肠中肠内胚层细胞群。在一些实施方案中，产生基本上肠中肠内胚层细胞群。在本专利技术的实施方案中，肠中肠内胚层细胞在培养物中形成并稳定为单层。在实施方案中，大于50％的分化细胞表达肠中肠内胚层的标记特征，优选地大于60％的分化细胞表达肠中肠内胚层的标记特征，更优选地大于70％、大于80％和大于90％的分化细胞表达肠中肠内胚层的标记特征。在实施方案中，分化细胞表达肠中肠内胚层(为肠中肠内胚层细胞)的标记特征。在实施方案中，肠中肠内胚层细胞表达CDX2和FOXA2。在所有实施方案中，肠中肠内胚层细胞表达选自由以下各项组成的组的转录因子：SOX9、PDX1、KLF5和HOXC5。在实施方案中，肠中肠内胚层细胞不表达选自由以下各项组成的组的转录因子：SOX2、ALB、PTF1A、HOXA13和LGR5。在本专利技术的实施方案中，通过步骤使人多能干细胞分化成肠中肠内胚层细胞，该步骤包括：a)在包含GDF-8和GSK3β抑制剂(诸如MCX化合物)的第一培养基中培养人多能干细胞，以诱导分化成定形内胚层细胞；b)在包含抗坏血酸和FGF7的第二培养基中培养定形内胚层细胞，以诱导分化成原肠管细胞；以及c)在包含视黄酸和BMP2或BMP4的第三培养基中培养原肠管细胞，以诱导分化成肠中肠内胚层细胞。在特定实施方案中，酸性条件为具有BLAR培养基的培养物。酸性培养物的pH可在6.8至7.2的范围内。在本专利技术的实施方案中，肠中肠内胚层细胞在培养物中形成单层。在实施方案中，肠中肠内胚层细胞的单层被保持在培养物中。本专利技术的另一个实施方案围治疗患有糖尿病或有患糖尿病风险的患者的方法，该方法包括使人多能干细胞分化成肠中肠内胚层细胞，以及在患有糖尿病的患者体内施用经分化的肠中肠内胚层细胞。在实施方案中，糖尿病为1型或2型。在实施方案中，施用细胞可经由植入、注射或以其他方式直接或间接施用到治疗部位。在一些实施方案中，肠中肠内胚层细胞植入体内，诸如皮下空间、网膜、肝脏、肾等。另外的实施方案涵盖对细胞的包封递送，包括对宏或微包封装置包封。本专利技术的另外的实施方案为产生肠中肠内胚层细胞的方法，包括在培养物中诱导定形内胚层细胞分化成原肠管细胞。在实施方案中，定形内胚层细胞在包含抗坏血酸和FGF7的培养基中培养。在另外的实施方案中，原肠管细胞在包含视黄酸和BMP2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备肠中肠内胚层细胞群的方法，包括在培养基中培养人多能干细胞以诱导分化成肠中肠内胚层细胞，其中产生基本上肠中肠内胚层细胞群。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.14 US 62/3226361.一种制备肠中肠内胚层细胞群的方法，包括在培养基中培养人多能干细胞以诱导分化成肠中肠内胚层细胞，其中产生基本上肠中肠内胚层细胞群。2.一种制备肠中肠内胚层细胞群的方法，包括在培养基中培养人多能干细胞以诱导分化成肠中肠内胚层细胞，其中所述分化细胞为肠中肠内胚层细胞，并且其中所述肠中肠内胚层细胞形成并保持稳定为单层。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中方法包括以下步骤：a.在包含GDF-8和GSK3β抑制剂化合物的第一培养基中将所述人多能干细胞培养成定形内胚层细胞；b.在包含抗坏血酸和FGF7的第二培养基中将所述定形内胚层细胞培养成原肠管细胞；以及c.在包含视黄酸和BMP2或BMP4的第三培养基中将原肠管细胞培养成肠中肠内胚层细胞。4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肠中肠内胚层细胞表达CDX2和FOXA2。5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肠中肠内胚层细胞表达选自由以下项组成的组的转录因子：SOX9、PDX1、KLF5和HOXC5。6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肠中肠内胚层细胞不表达选自由以下项组成的组的转录因子：SOX2、ALB、PTF1A，HOXA13和LGR5。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肠中肠内胚层细胞在培养物中形成并保持单层。8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细胞群不包括间充质细胞。9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细...

【专利技术属性】
技术研发人员：S里克，A雷扎尼亚，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US