基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物、筛选方法及鉴定方法技术

本发明专利技术公开基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物、筛选方法及鉴定方法，8对油橄榄扩增引物。本发明专利技术通过对油橄榄品种叶片DNA，经限制性内切酶酶切、克隆测序、基因组比对分析，挑选高度可靠性和可重复性单拷贝片段，选单拷贝片段设计扩增引物；再以选单拷贝片段设计扩增引物，对油橄榄品种叶片DNA进行PCR扩增，筛选出扩增效率高、变异丰富的8对单拷贝核基因标记物，8对油橄榄扩增产物相对较纯，峰形清晰，不需要荧光引物，检测价格低廉；可利用8对油橄榄单拷贝核基因标记物进行油橄榄品种鉴定。

【技术实现步骤摘要】
基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物、筛选方法及鉴定方法
本专利技术涉及生物
具体地说是基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物、筛选方法及鉴定方法。
技术介绍
油橄榄(OleaeuropaeaL.)是仅次于油棕的世界第二大木本油料植物，为木犀科木犀榄属常绿乔木，主要用以鲜果加工橄榄油，橄榄油富含单不饱和脂肪酸和抗氧化物质，具有重要的营养价值，素有“液体黄金”的美誉。油橄榄广泛分布于地中海地区，目前全世界油橄榄种植面积已超过880万hm2。我国自20世纪60年代首次从阿尔巴尼亚引种油橄榄以来，收集和引进了大量的国外油橄榄品种资源，现有登记品种近200个。油橄榄在不同国家和地区间的频繁引种活动致使其品种混乱，同物异名和同名异物现象非常严重，品种鉴定工作亟待进行。前期已有大量利用RAPD、AFLP、ISSR、SSR等标记对油橄榄品种进行鉴定的研究，通常认为SSR标记在油橄榄品种鉴定中较为有效。但是，在实际应用中SSR标记并不是特别理想，主要表现在以下方面：(1)重复区造成扩增错误率增加，扩增多了或者少了一到几个重复单元，造成产物多种，峰形混乱，影响判读；(2)对于群体内与主要等位基因长度差别较大的稀有等位基因，不同的研究者，主观判断不同，容易造成鉴定偏差；(3)SSR检测价格昂贵，其产物检测主要使用一代测序仪检测，需要在其中一端标记荧光染料(如HEX)，而且此种引物不耐储藏。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物、筛选方法及鉴定方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物，其特征在于，包括8对油橄榄扩增引物；SWH1的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，SWH2的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，SWH3的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示，SWH4的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示，SWH5的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示，SWH6的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示，SWH7的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：13和SEQIDNO：14所示，SWH8的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：15和SEQIDNO：16所示。基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物的筛选方法，提取油橄榄品种叶片DNA，经限制性内切酶酶切、克隆测序、以及基因组比对分析，挑选单拷贝片段设计引物，对油橄榄品种叶片DNA进行PCR扩增，筛选出扩增效率高、变异丰富进行油橄榄品种鉴定的单拷贝核基因标记扩增引物。上述基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物的筛选方法，包括如下步骤：(1)选取20个油橄榄品种，采集叶片，提取油橄榄叶片DNA；(2)随机选用其中一个品种的叶片DNA，利用限制性内切酶将DNA酶切成500-2000bp左右的片段；(3)使用克隆载体随机包装酶切片段，转化至大肠杆菌中；(4)涂板培养，随机挑多个单克隆菌斑测序；(5)将测得的序列在已发布的油橄榄基因组中进行BLAST，如果某片段在油橄榄基因组中存在不止一个拷贝，丢弃该片段，否则，该片段为单拷贝核基因片段；(6)将步骤(5)中筛选得到的单拷贝核基因片段，设计扩增引物，扩增目的片段控制在500-1500bp之间；(7)使用步骤(6)中设计扩增引物对步骤(1)中的20个油橄榄品种的叶片DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，选取条带清晰单一、所有品种都能扩出产物的序列，使用ABI3730XL测序仪对其进行测序；(8)选取步骤(7)中扩增产物变异丰富、能够区分至少两个品种的引物作为油橄榄品种鉴定标记，筛选出共8对油橄榄扩增引物，分别为：SWH1的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，SWH2的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，SWH3的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示，SWH4的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示，SWH5的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示，SWH6的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示，SWH7的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：13和SEQIDNO：14所示，SWH8的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：15和SEQIDNO：16所示。基于SNP位点的油橄榄品种鉴定方法，包括如下步骤：(2-1)采集待的检测油橄榄品种的叶片材料，提取油橄榄叶片DNA；(2-2)使用权利要求1所述的8对油橄榄扩增引物，分别待检测的油橄榄的叶片DNA进行扩增，测序；(2-3)使用ContigExpress软件将序列首末端和测序质量低的区域去掉，并修改呈现双峰的简并碱基；(2-4)将序列输出成fasta格式，并将8条序列进行合并，导入BioEdit软件，和已有的基于权利要求1中8对油橄榄扩增引物构建的油橄榄品种信息库内的其他品种序列对排；(2-5)使用ClustalX软件构建Neighbor-Joining树，当待检测油橄榄与和已有的基于权利要求1中8对油橄榄扩增引物构建的油橄榄品种信息库内某个油橄榄品种X聚集在一起时，说明待检测油橄榄与这个油橄榄品种X的遗传关系很近；(2-6)再在BioEdit软件中对待检测油橄榄和步骤(2-5)遗传关系很近的油橄榄品种X的变异位点差异进行检查，如果待检测油橄榄和油橄榄品种X两者没有差别，则待检测油橄榄就为油橄榄品种X，如果待检测油橄榄和油橄榄品种X两者存在差别，则待检测油橄榄品种不在已有的基于权利要求1中8对油橄榄扩增引物构建的油橄榄品种信息库内，则该待检测品种为油橄榄新品种。上述基于SNP位点的油橄榄品种鉴定方法，在步骤(2-2)中，PCR扩增均使用30uL反应体系：20ngDNA，10×buffer缓冲液3uL，2.4mM的dNTPs2.4uL，10uM的引物2.4uL，正向引物和反向引物各1.2uL，TaqDNA聚合酶0.15uL；PCR扩增使用ABI96UThermocyclerPCR仪；PCR扩增的反应程序为：预变性：94℃、4min；变性：94℃、30s，退火：60℃、30s，以及延伸：72℃、2min，共计10个循环；变性：94℃、30s，退火：55℃、30s，以及延伸：72℃、2min，共计26个循环；延伸：72℃、10min。本专利技术的技术方案取得了如下有益的技术效果：本专利技术通过对油橄榄品种叶片DNA，经限制性内切酶酶切、克隆测序、基因组比对分析，挑选高度可靠性和可重复性单拷贝片段，选单拷贝片段设计扩增引物；再以选单拷贝片段设计扩增引物，对油橄榄品种叶片DNA进行PCR扩增，筛选出扩增效率高、变异丰富的8对单拷贝核基因标记物，8对油橄榄扩增产物相对较纯，峰形清晰，不需要荧光引物，检测价格低廉；可利用8对对油橄榄单拷贝核基因标记物进行油橄榄品种鉴定。本专利技术将单拷贝核基因片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物，其特征在于，包括8对油橄榄扩增引物；SWH1的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，SWH2的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，SWH3的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，SWH4的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，SWH5的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，SWH6的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示，SWH7的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示，SWH8的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示。

【技术特征摘要】
1.基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物，其特征在于，包括8对油橄榄扩增引物；SWH1的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，SWH2的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，SWH3的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示，SWH4的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示，SWH5的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示，SWH6的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示，SWH7的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：13和SEQIDNO：14所示，SWH8的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：15和SEQIDNO：16所示。2.基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物的筛选方法，其特征在于，提取油橄榄品种叶片DNA，经限制性内切酶酶切、克隆测序、以及基因组比对分析，挑选单拷贝片段设计引物，对油橄榄品种叶片DNA进行PCR扩增，筛选出扩增效率高、变异丰富进行油橄榄品种鉴定的单拷贝核基因标记扩增引物。3.根据权利要求2所述的基于SNP位点的油橄榄品种鉴定的扩增引物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选取20个油橄榄品种，采集叶片，提取油橄榄叶片DNA；(2)随机选用其中一个品种的叶片DNA，利用限制性内切酶将DNA酶切成500-2000bp左右的片段；(3)使用克隆载体随机包装酶切片段，转化至大肠杆菌中；(4)涂板培养，随机挑多个单克隆菌斑测序；(5)将测得的序列在已发布的油橄榄基因组中进行BLAST，如果某片段在油橄榄基因组中存在不止一个拷贝，丢弃该片段，否则，该片段为单拷贝核基因片段；(6)将步骤(5)中筛选得到的单拷贝核基因片段，设计扩增引物，扩增目的片段控制在500-1500bp之间；(7)使用步骤(6)中设计扩增引物对步骤(1)中的20个油橄榄品种的叶片DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，选取条带清晰单一、所有品种都能扩出产物的序列，使用ABI3730XL测序仪对其进行测序；(8)选取步骤(7)中扩增产物变异丰富、能够区分至少两个品种的引物作为油橄榄品种鉴定标记，筛选出共8对油橄榄扩增引物，分别为：SWH1的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，SWH2的正向引物和反向引物分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，SWH3的正向引物和反向引物分别如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵文豪，王兆山，张建国，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11