本发明专利技术公开了一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，提取金花茶中的黄酮类物质，以作用于体外培养的CNE‑1、CNE‑2、C666‑1等鼻咽癌细胞株为模型，应用激光共聚焦倒置显微镜、荧光标记mRNA差异显示技术、蛋白组学方法及基质辅助飞行时间质谱等技术，发现金花茶提取物中黄酮类物质可抑制鼻咽癌癌细胞增殖、并诱导其凋亡，并定位检测bcl‑2、notch1等基因在鼻咽癌中的表达，从蛋白水平的变化揭示了金花茶中黄酮类物质抑制鼻咽癌活性的有效位点。本发明专利技术还可以通过差异表达的蛋白进行深入研究，阐明其作用的机制，同时这些蛋白有可能作为临床上治疗鼻咽癌药物作用的靶分子。
【技术实现步骤摘要】
一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法
本专利技术涉及生物
，具体是一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点筛选方法，是以作用于体外培养的鼻咽癌细胞株为模型，通过差异显示反转录聚合酶链式反应技术(DDRT-PCR)、蛋白组学方法等技术，观察金花茶提取物中黄酮类物质抑制鼻咽癌细胞增殖、诱导凋亡及蛋白变化水平效果，经数据库检索匹配，筛选出外源性金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用的有效位点。
技术介绍
金花茶属于山茶科、山茶属，是我国八种国家一级保护植物之一，《本草纲目》有载：“山茶产南方……，又有一捻红，千叶红、千叶白等名，或云亦有黄色者”；广西《地方志》亦有记载：“金花茶，常绿灌木，生长在荒山野岭中”，被誉为“植物界大熊猫”、“茶族皇后”。卫生部2010年第9号文件，批准金花茶、酵母β-葡聚糖、雪莲培养物等5种物品为新资源食品。研究发现，金花茶叶和花中富含总黄酮(异黄酮、双黄酮、花色苷及新黄酮类等)、茶多酚，茶多糖、挥发性精油、多种氨基酸等成分。黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物，包括黄酮、黄烷醇、异黄酮、双氢黄酮、双氢黄酮醇、噢弄、黄烷酮、花色素、查耳酮、色原酮等，现已发现约4000余种黄酮类化合物，主要存在于植物的叶、果实、根、皮中，实验证明其具有广泛的生理和药理活性(包括抗氧化，清除氧自由基、抗病毒、抗癌、抗炎、抗衰老等)，因此对该化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门话题(张睿，徐雅琴，时阳.黄酮类化合物提取工艺研究.食品与机械，2003，01，21-22)。目前尚较少文献涉及金花茶中黄酮类物质在抑制鼻咽癌的分子生物学或流行病学等相关报道。仅有的一些文献涉及较为笼统的概念，如金花茶醇提物或水提物抗肿瘤活性等，但由于被研究对象成分非常复杂，较难确定真正抑瘤为何种活性成分，以及相关活性成分的有效作用位点。现有相关文献如：朱华等将人鼻咽癌CNE-2细胞分为两组,实验组加入终浓度为25、50、100、200、400μg/mL的金花茶醇提物,对照组不加药物,采用MTT(噻唑蓝)法检测两组24、48、72h增殖抑制率,倒置相差显微镜及荧光显微镜观察48h后细胞形态的变化,流式细胞仪分析细胞周期变化及凋亡率。结果显示金花茶醇提物对CNE-2细胞的增殖有抑制作用(朱华，邹登峰，沈洁，张可峰，张小玲，朱林.金花茶醇提物对人低分化鼻咽癌CNE-2细胞增殖和周期的影响.山东医药，2011，51，19-21)。农彩丽等在金花茶总黄酮体外抗肿瘤活性的实验研究中采用噻唑蓝染色法(MTF法)检测金花茶总黄酮在体外对人肝癌细胞株(SMMC-7721)、人高分化鼻咽癌细胞株(CNE-1)、人胃腺癌细胞株(SGC-7901)、人大细胞肺癌细胞株(H460)的增殖抑制率，并计算相应的半数生长抑制浓度(IC50)。结果金花茶总黄酮对SMMC-7721、CNE-1、SGC-7901、H460均有抑制作用(P＜0.05)，且呈一定的浓度依赖性，IC50分别242.44μg/mL、313.79μg/mL、259.87μg/mL、385.87μg/mL(农彩丽，陈永欣，何显科，韦锦斌.金花茶总黄酮体外抗肿瘤活性的实验研究.中国癌症防治杂志，2012，4，324-327)；韦锦斌等在金花茶体外抗肿瘤活性及物质基础的初步研究中检测金花茶不同萃取部位体外对人胃腺癌细胞株(SGC-7901)、人大细胞肺癌细胞株(H460)、人肝癌细胞株(SMMC-7721和BEL-7404)、人高分化鼻咽癌细胞株(CNE-1)作用48h后的增殖抑制率,并计算相应的半数生长抑制浓度(IC50),水层部位对上述5种细胞株的IC50分别为:81.72,73.47,95.98,73.41,61.25mg·L-1；水层萃取部分检测到的物质有24个,初步鉴定了其中的11个成分。作者研究结论为金花茶不同萃取部位体外实验有抗肿瘤活性,水层部分可能是金花茶抗肿瘤作用的主要活性部位；需要进一步对水层部分的这些可能活性物质进行分离纯化鉴定以及定量分析(韦锦斌，农彩丽，苏志恒，陈永欣，吕淑娟，潘宇政.金花茶体外抗肿瘤活性及物质基础的初步研究，中国实验方剂学杂志，2014，20，169-175)；也有作者研究了非金花茶黄酮成分抑制鼻咽癌活性研究，如韩宏裕等探讨了染料木黄酮对未分化鼻咽癌细胞的增殖抑制作用。采用MTT法检测染料木黄酮对未分化鼻咽癌细胞株生长的影响，采用流式细胞术检测染料木黄酮作用于未分化鼻咽癌细胞株后细胞周期的变化。结果显示染料木黄酮对不同的未分化鼻咽癌细胞株CNE-2和C666-1均具有增殖抑制作用，作用方式呈时间－剂量－效应关系(韩宏裕，刘然义，黄文林.染料木黄酮对未分化鼻咽癌细胞株的增殖抑制作用.实用医学杂志,2013,29(9),1382-1385)。专利200710066974.X：“邻-二羟基黄酮-硒配合物制备方法及医学用途”制备了一类芦丁-硒配合物，并开展了其对鼻咽癌细胞CNE2体外抑制试验，得到一组实验数据。聚酰胺-胺型树状大分子具有丰富的端氨基结构及内部仲、季胺结构，使整体聚酰胺-胺型树状大分子呈弱碱性。黄酮类化合物大多具有酚羟基,整体呈弱酸性，呈弱碱性的PAMAM树状大分子材料对呈弱酸性的黄酮类物质有较强的萃取吸附作用。为更好地对PAMAM吸附后的黄酮类物质进行分离，本专利技术将PAMAM与磁性纳米粒子四氧化三铁、γ-三氧化铁、Fe2N等进行复合制备磁性粒子-PAMAM纳米复合材料，通过磁性作用将萃取吸附有弱酸性黄酮物质的磁性粒子-PAMAM纳米复合材料从金花茶萃取液中分离。鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤。是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。常见临床症状为鼻塞、涕中带血、耳闷堵感、听力下降、复视及头痛等。鼻咽癌曾被称为广东瘤(Cantontumor),主要发生于我国南方五省，即广东、广西、湖南、福建和江西，占当地头颈部恶性肿瘤的首位。东南亚国家也是高发区。据世界卫生组织估计，全球约80％的鼻咽癌发生在中国。发病率男性达30/10万以上，女性也超过15/10万以上。分子遗传学研究发现，鼻咽癌肿瘤细胞发生染色体变化的主要是1、3、11、12和17号染色体，在鼻咽癌肿瘤细胞中发现多染色体杂合性缺失区(1p、9p、9q、11q、13q、14q和16q)可能提示鼻咽癌发生发展过程中存在多个肿瘤抑癌基因的变异。肿瘤细胞的增殖与凋亡和所涉及的重要基因以及蛋白的表达异常、癌基因的激活或抑癌基因的突变缺失、DNA损伤修复基因的突变以及细胞信号转导异常等，是介导肿瘤发生、发展的重要分子基础。对于黄酮类物质的研究表明，它们的抗氧化和对致癌物的清除，可能涉及肿瘤发生的分子事件，影响到肿瘤的启动、促进和进展各个阶段。因此，对金花茶中黄酮类物质抗肿瘤作用从细胞水平、基因和蛋白质表达水平进行深入研究和探讨，可能为抗肿瘤作用分子机制的深入阐明，提供新的线索。现有文献研究较为笼统(醇提物或水提物)，被研究对象成分非常复杂，较难确定真正抑瘤活性成分，以及相关有效作用位点。需要进一步对水层部分的这些可能活性物质进行分离纯化鉴定以及定量分析(韦锦斌，农彩丽，苏志恒，陈永欣本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，其特征在于包括如下具体步骤：1)金花茶中的黄酮类物质的提取金花茶花朵浓缩液制备：采摘秋季新鲜的金花花朵，筛选、洗净、粉碎，将粉碎后的金花茶花朵0.8‑1.2公斤；加入95％以上的乙醇2.0L，利用索氏提取器提取5‑6h，得提取液A；提取后残渣加入95％以上的丙酮1.0‑1.8L，在40‑60℃条件下超声1‑2h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去丙酮或乙醇溶剂，得到有机相的金花茶花朵浓缩液0.2‑0.3L；四氧化三铁磁粒子‑PAMAM复合材料制备过程：在氮气保护下，pH＝1.7时，制备0.085mol/L的三氯化铁溶液和0.05mol/L的硫酸亚铁的混合物；往此混合物中滴加1.5mol/L的氨水溶液，并剧烈搅拌，直至pH＝9；所获得的四氧化三铁磁性纳米粒子立即用水洗涤5次，然后用甲醇洗涤3次，磁分离把四氧化三铁磁粒子分散于甲醇之中，获得的分散液浓度为0.0128mol/L；上述制备的25mL的四氧化三铁磁粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL，并超声处理30min；然后加入10mL的3‑胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h；所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt％的溶液备用；取50mL的5wt％的四氧化三铁磁粒子甲醇溶液为起始溶液，加入200mL含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的体积浓度为20％，把此混合液在室温水浴中超声7h；然后用磁铁收集磁性纳米粒子，随后用甲醇洗涤5次，并磁分离；在洗涤之后，向该磁性纳米粒子的甲醇溶液中加入40mL含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的体积浓度为50％，室温下超声处理3h；然后用甲醇洗涤该磁性纳米粒子5次，并进行磁分离；重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环四次得到四代树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子；此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得PAMAM树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子，即四氧化三铁磁粒子‑PAMAM复合材料；将制备得到的四氧化三铁磁粒子‑PAMAM复合材料2‑3g加入到第一步制备好的0.2‑0.3L金花茶花朵萃取液中，在400W条件下超声萃取1h，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取黄酮类物质的四氧化三铁磁粒子‑PAMAM复合材料分离，分离后的吸附有黄酮物质的四氧化三铁磁粒子‑PAMAM复合材料采用有机溶剂乙醇萃取3‑5次，合并萃取液，旋转蒸发得到金花茶中的黄酮类物质；2)体外培养的鼻咽癌细胞CNE‑1、CNE‑2、CNE‑2Z、HNE‑2、C666‑1、NP29、5‑8F和6‑10B，上述细胞均贴壁生长于RPMI 1640培养基中，在37℃、5％的CO2、饱和湿度下传代培养。实验分组：黄酮组、阳性对照组，溶剂对照组和空白对照组，其中黄酮组中黄酮各剂量组分别为10、20、30、50和90μmol/L；阳性对照组顺铂用药剂量为0.25μmol/L；溶剂对照组加入终浓度为0.1％的DMSO；空白对照组仅加入等体积培养液，不加药物和细胞；3)检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的作用a)采用MTT法检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用，用流式细胞仪分析细胞周期，具体步骤包括取对数生长期CNE‑1、CNE‑2、CNE‑2Z、HNE‑2、C666‑1、NP29、5‑8F和6‑10B中的一种或两种以上，经质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化，接种于96孔培养板内，5×103个细胞/孔，预培养24h，待细胞贴壁后吸出全部上清，按实验分组加入不同浓度的各种受试物，总体积200μl/孔，每一剂量组设4个复孔；分别培养24、48、72和96h，每孔加入20μl浓度为5mg/L的MTT，继续培养4h，弃去培养液，每孔加200μl的DMSO，平板摇床摇震10min，以DMSO调零，用酶联免疫检测仪以490nm波长测定各孔吸光值A，计算平均A值、增殖率PR及抑制率CIR；增殖率PR＝(实验组A值/溶剂对照组A值)×100％；抑制率CIR＝(1‑试验组平均A值/对照组平均A值)×100％；运用曲线回归分析，求出剂量反应关系方程及回归系数；b)根据MTT比色法的结果，选取合适的浓度按照实验设计处理细胞；取对数生长期的鼻咽癌细胞，调整密度2.5×104个/mL，置28cm2培养瓶中，培养24h待细胞贴壁后加入不同浓度处理因素，于96h终止培养；取步骤a)中的细胞，弃去培养液，质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化，2000r/min离心l0min，弃上清液，将细胞沉淀重悬于PBS液中，调整细胞密度至1×106个/m1，2000r/min离心l0min，弃上清液；快速加入4℃预冷的75％乙醇1ml，使细胞重悬，4℃下保温10‑15h；取单细胞悬液lml，加入l0μg/ml的荧光染料碘化丙啶...
【技术特征摘要】
1.一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，其特征在于包括如下具体步骤：1)金花茶中的黄酮类物质的提取金花茶花朵浓缩液制备：采摘秋季新鲜的金花花朵，筛选、洗净、粉碎，将粉碎后的金花茶花朵0.8-1.2公斤；加入95％以上的乙醇2.0L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A；提取后残渣加入95％以上的丙酮1.0-1.8L，在40-60℃条件下超声1-2h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去丙酮或乙醇溶剂，得到有机相的金花茶花朵浓缩液0.2-0.3L；四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料制备过程：在氮气保护下，pH＝1.7时，制备0.085mol/L的三氯化铁溶液和0.05mol/L的硫酸亚铁的混合物；往此混合物中滴加1.5mol/L的氨水溶液，并剧烈搅拌，直至pH＝9；所获得的四氧化三铁磁性纳米粒子立即用水洗涤5次，然后用甲醇洗涤3次，磁分离把四氧化三铁磁粒子分散于甲醇之中，获得的分散液浓度为0.0128mol/L；上述制备的25mL的四氧化三铁磁粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL，并超声处理30min；然后加入10mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h；所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt％的溶液备用；取50mL的5wt％的四氧化三铁磁粒子甲醇溶液为起始溶液，加入200mL含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的体积浓度为20％，把此混合液在室温水浴中超声7h；然后用磁铁收集磁性纳米粒子，随后用甲醇洗涤5次，并磁分离；在洗涤之后，向该磁性纳米粒子的甲醇溶液中加入40mL含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的体积浓度为50％，室温下超声处理3h；然后用甲醇洗涤该磁性纳米粒子5次，并进行磁分离；重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环四次得到四代树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子；此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得PAMAM树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子，即四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料；将制备得到的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料2-3g加入到第一步制备好的0.2-0.3L金花茶花朵萃取液中，在400W条件下超声萃取1h，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取黄酮类物质的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料分离，分离后的吸附有黄酮物质的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料采用有机溶剂乙醇萃取3-5次，合并萃取液，旋转蒸发得到金花茶中的黄酮类物质；2)体外培养的鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2、CNE-2Z、HNE-2、C666-1、NP29、5-8F和6-10B，上述细胞均贴壁生长于RPMI1640培养基中，在37℃、5％的CO2、饱和湿度下传代培养。实验分组：黄酮组、阳性对照组，溶剂对照组和空白对照组，其中黄酮组中黄酮各剂量组分别为10、20、30、50和90μmol/L；阳性对照组顺铂用药剂量为0.25μmol/L；溶剂对照组加入终浓度为0.1％的DMSO；空白对照组仅加入等体积培养液，不加药物和细胞；3)检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的作用a)采用MTT法检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用，用流式细胞仪分析细胞周期，具体步骤包括取对数生长期CNE-1、CNE-2、CNE-2Z、HNE-2、C666-1、NP29、5-8F和6-10B中的一种或两种以上，经质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化，接种于96孔培养板内，5×103个细胞/孔，预培养24h，待细胞贴壁后吸出全部上清，按实验分组加入不同浓度的各种受试物，总体积200μl/孔，每一剂量组设4个复孔；分别培养24、48、72和96h，每孔加入20μl浓度为5mg/L的MTT，继续培养4h，弃去培养液，每孔加200μl的DMSO，平板摇床摇震10min，以DMSO调零，用酶联免疫检测仪以490nm波长测定各孔吸光值A，计算平均A值、增殖率PR及抑制率CIR；增殖率PR＝(实验组A值/溶剂对照组A值)×100％；抑制率CIR＝(1-试验组平均A值/对照组平均A值)×100％；运用曲线回归分析，求出剂量反应关系方程及回归系数；b)根据MTT比色法的结果，选取合适的浓度按照实验设计处理细胞；取对数生长期的鼻咽癌细胞，调整密度2.5×104个/mL，置28cm2培养瓶中，培养24h待细胞贴壁后加入不同浓度处理因素，于96h终止培养；取步骤a)中的细胞，弃去培养液，质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化，2000r/min离心l0min，弃上清液，将细胞沉淀重悬于P...
【专利技术属性】
技术研发人员：程金生，
申请(专利权)人：程金生，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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