含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物的培养方法及其应用技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，本发明专利技术在原有分离出来的草螺菌的基础上，对其进行详细的鉴定分析，对其进行了更详细的分类，得到Herspirillum huttitense5‑28，简称亚种H.5‑28；同时，具体提供了亚种H.5‑28菌种的快速大量培养方法，包括菌种活化、种子液的制备、发酵培养的具体培养过程，其中，所述发酵培养的培养条件为：液体培养基，接种量3％，28‑37℃，180r/min，培养时间48h；还提供了以该菌种为主要活性物质制备出的生物菌肥和该生物菌肥的制备方法；以及利用该生物菌肥在抵抗玉米青枯病、小麦纹枯病、附子根腐病多种病原菌害中的应用。

【技术实现步骤摘要】
含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物的培养方法及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物的培养方法及其应用。
技术介绍
植物生长促进菌(PGPB，PlantGrowthPromotingBacterium)可以促进宿主植物生长发育，减少胁迫，提高抗逆性，增强宿主植物适应能力。施用植物促生菌及相关生物菌肥，是当前生态农业的首选。已报道的植物促生菌主要为假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮螺菌属(Azospirilum)、克雷伯菌属(Klebsiella)、草螺菌属(Herbaspirillum)等菌株。草螺菌(Herbaspirillumsp.)是一类嗜用有机酸、耐性强、微需氧、略呈弯曲的革兰氏阴性非发酵杆菌，可在高糖培养基上生长但不利用蔗糖的细菌类群。草螺菌(Herbapirillumsp.)隶属变形杆菌门(Proteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、伯克霍尔德氏目(Burkholderiale)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、草螺菌属(Herbaspirillum)，大多分布在植物的根部或者茎干。1982年首次报道了草螺菌属的第一个种H.seropedicae。截至2017年底，已报到该属十多种。这些Herbaspirillum属细菌功能各异。如H.aquaticum是人体致病菌，H.chlorophenolicum可以降解环境中的4-氯酚，而H.frisingense和H.seropedicae可以促进植物生长，其促生机制包括固氮、溶磷、和提高植物乙烯合成。H.rubrisubalbicans既可以降解环境中的污染物，也可引起水稻的病害。Herbapirillum属中，即使是同种菌，不同的菌株生物学特性也相差很大。如H.seropedicae菌株Os45能引起水稻根系病害，菌株RAM4能降低蚕豆根系干重，而菌株Z-152却能显著提高玉米的抗旱性。总体来说Herbaspirillum属的不同菌种特性各异，其中能够促进植物生长和降解环境污染物的菌种具有很好应用开发前景。Herbaspirillumhuttitense5-28(以下简称亚种H.5-28)(CCTCCNO：M2017149)是在中药材附子体内分离得到的根系促生菌，研究表明其具有促进植物生长、提高植物抗病性的作用。LysobacteryanansisSNNU513(CGMCCNo.8375，ATCCBAA-2621)(以下简称SNNU513)是在中药材远志根系分离获得的一株细菌，该细菌能定殖于植物体内，通过分泌抗菌蛋白质拮抗诸多病原菌。枯草芽孢杆菌是目前常用的一类生防菌。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供该亚种H.5-28菌种大量培养方法。本专利技术的第二个目的是提供该亚种H.5-28菌种或以该菌种为主要活性成分所制备出来的生物菌肥在抗玉米青枯病、小麦纹枯病、附子根腐病中的新的应用。本专利技术中的主要细菌为草螺菌属(Herbaspirillum)的亚种H.5-28，本专利技术中已经对其作了详细的分析并对其进行更详细的命名。该菌于2017年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国武汉大学，保藏号为CCTCCNO：M2017149。其基因组包含大小两条染色体，无基因岛，无CRISPR系统，可转化硝酸盐，可固氮、溶磷，可分泌水杨酸和吲哚乙酸。所述本专利技术亚种H.5-28菌株的菌落特征为：NA琼脂平板生长菌落小，淡黄色，菌落质地粘液性、表面光滑、反光，菌落边缘整齐平滑，菌体为略弯曲的杆状，大小0.6-0.7μm×2-4μm，适宜生长温度28℃-37℃，为兼性厌氧型菌株。亚种H.5-28菌种培养方法，以亚种H.5-28菌种为原料，包括下述步骤，(1)菌种活化：将亚种H.5-28菌株接种到固体NA斜面培养基中，34℃活化培养48h；(2)种子液的制备：从所述步骤(1)中的固体NA斜面培养基上挑取亚种H.5-28单菌落，接种到液体培养基中，在34℃、180r/min的条件下培养12-16h，得到种子液；(3)发酵培养：将所述步骤(2)得到的种子液进行发酵培养，得到发酵液；所述发酵培养的培养条件为：液体培养基，接种量3％，28-37℃，180r/min，培养时间48h。作为本专利技术进一步的方案，所述步骤(1)中，所述固体NA斜面培养基的配方为，蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl5g，氨苄青霉素75mg，琼脂15g，水1000ml，pH6.8-7.2；连续转接3代，确保菌株纯度。作为本专利技术进一步的方案，在所述步骤(2)和所述步骤(3)中，所述液体培养基的配方相同，均为，每升无菌水中，葡萄糖10g，蛋黄卵磷脂0.2g(75％的乙醇溶解)，CaCO35g，K2HPO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.002g，MnSO4·7H2O0.002g，NaCl0.1g，KCl0.1g，氨苄青霉素75mg，pH6.8-7.2。本专利技术还提供了一种生物菌肥，该生物菌肥是由上述所述的亚种H.5-28菌种为主要活性成分制备出来的。该生物菌肥的制备方法是，(1)室温下配制包埋剂溶液(W/V)，包含：海藻酸钠3％、聚乙烯醇2.5％、SiO23.5％和CaCO30.3％；高温高压灭菌20min，冷却至室温，得包埋剂溶液A；(2)平板划线培养LysobacteryanansisSNNU513(CGMCCNo.8375，ATCCBAA-2621)(简称SNNU513)和枯草芽孢杆菌菌株：分别挑取SNNU513和枯草芽孢杆菌菌株的单克隆菌落，并分别接种至250mlLB液体培养基中，在37℃，180r/min的培养条件下培养至对数期；(3)将所培养好的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物和步骤(2)活化好的SNNU513、枯草芽孢杆菌按体积比5:3:2接种于LB液体培养基，在37℃，180r/min的培养条件下培养18-20h，得到混合菌培养物B；(4)将所述步骤(1)得到的包埋剂溶液A和所述步骤(3)得到的混合菌培养物B按质量比5:2混合，恒温搅拌混匀，然后匀速加入到交联剂溶液(2.5％CaCl2)中，使滴入液形成2-3mm的小球，交联24h，滤出颗粒，用无菌水洗涤，得包埋颗粒C；(5)将所述步骤(4)得到的包埋颗粒C转移到LB液体培养基中，接种量40％，在34℃、180r/min的条件下培养72h，得微生物菌剂D；(6)将所述步骤(5)得到的微生物菌剂D恒温干燥至恒重，得到该生物菌肥。进一步的，本专利技术还提供了该生物菌肥在抗玉米青枯病、小麦纹枯病、附子根腐病多种病害中的应用。本专利技术早前在乌头不同部位分离出来内生菌Herbaspirillumsp.Aconite5-28，其能提高植物活力，促进植物生长，能定殖于植物的茎和叶中。基于此，本专利技术系统鉴定该菌株为亚种H.5-28(CCTCCNO：M2017149)，本专利技术提供了一种亚种H.5-28菌株的培养方法，本专利技术还提供了一种以亚种H.5-28菌种为主要活性成分制备的生物菌肥。本专利技术还提供了该生物菌肥在抗玉米青枯病、小麦纹枯病、附子根腐病中的应用。本专利技术方法具有如下优点：本专利技术中的亚种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有亚种H.5‑28菌种的细菌培养物。

【技术特征摘要】
1.一种含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物。2.权利要求书1所述的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物的培养方法，其特征在于，包括下述步骤，2.1菌种活化：将亚种H.5-28菌株接种到固体NA斜面培养基中，于34℃活化培养48h；2.2种子液的制备：从所述步骤2.1中的固体NA斜面培养基上挑取亚种H.5-28单菌落，接种到液体培养基中，在34℃、180r/min的条件下培养12-16h，得到种子液；2.3发酵培养：将所述步骤2.2得到的种子液进行发酵培养，得到发酵液；所述发酵培养的培养条件为：液体培养基，接种量3％，28-37℃，180r/min，培养时间48h。3.如权利要求2所述的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物的培养方法，其特征在于，在所述步骤2.2和所述步骤2.3中，所述液体培养基的配方相同，均为：每升无菌水中，葡萄糖10g，蛋黄卵磷脂0.2g(75％的乙醇溶解)，CaCO35g，K2HPO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.002g，MnSO4·7H2O0.002g，NaCl0.1g，KCl0.1g，氨苄青霉素75mg，pH6.8-7.2。4.如权利要求1所述的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物，其特征在于，所述细菌培养物中含有吲哚乙酸和水杨酸。5.权利要求1所述的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物在提高植物抗病性中的应用。6.一种生物菌肥，其特征在于，所述生物菌肥是由权利要求1或权利要求2或权利要求3中所述的含有亚种H.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔浪军，王冬阁，周彬，史晓菲，张鑫，冯正平，陈雪，黄自华，闫亚平，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61