基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针制造技术

本发明专利技术利用G蛋白偶联受体(GPCR)感受特定配体并发生构象改变的特点，在G蛋白偶联受体的第三胞内环中插入循环重排的荧光蛋白，将G蛋白偶联受体的构象改变转变为光学信号的变化，通过检测光学信号的变化来检测所述特定配体的浓度，以此为原理构建基于GPCR的激活的荧光探针(GRAB探针)。本发明专利技术还公开了利用GRAB探针检测特定配体的方法。

【技术实现步骤摘要】
基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针专利
本专利技术涉及基因编码的基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针。
技术介绍
由于神经递质在神经系统中的重要作用，从第一个神经递质乙酰胆碱被鉴定到现在为止近100年的时间，很多科学家都进行了关于神经递质的性质、合成、储存、释放和作用等多方面的研究(Valenstein,E.S.Thediscoveryofchemicalneurotransmitters.Brainandcognition49,73-95(2002))。然而，与现如今飞速发展的认知神经生物学领域相比，检测神经递质的技术仍然受限于低时空分辨率和细胞特异性，这使得我们对于递质的释放和作用的精细刻画变得困难。通过微透析方法偶联生化分析检测为经典的研究神经递质释放的方法之一。该方法最早由BitoL于1966年开发，用于检测大脑中多种氨基酸的含量及动态变化(Justice,J.B.Quantitativemicrodialysisofneurotransmitters.JournalofNeuroscienceMethods48,263-276(1993))。Understedt和Pycock作为该领域的先驱，改进并发展了微透析技术并应用该技术进行了多种重要神经递质如多巴胺在大脑神经环路中的检测(Watson,C.J.,Venton,B.J.&Kennedy,R.T.Invivomeasurementsofneurotransmittersbymicrodialysissampling.Analyticalchemistry78,1391-1399(2006))。该方法虽然可以达到检测神经递质的目的，但由于其需要通过透析膜获得神经递质并借助生化方法分离鉴定特定分子，其极大地缺乏递质释放的时空信息，并且由于其复杂的操作，难以保证对于生理状态的完整的体现。现如今发展的精细微透析nano-LC-microdialysis通过进一步增加生化检测过程的分辨率使得我们可以对组织中的极少量神经递质进行细致的分离和刻画，所需样品体积最小可以达到4nL，时间分辨率上升到数秒，然而其还是难以较差的空间分辨率导致的缺乏细胞特异性检测的缺陷(Olive,M.F.,Mehmert,K.K.&Hodge,C.W.Microdialysisinthemousenucleusaccumbens:Amethodfordetectionofmonoamineandaminoacidneurotransmitterswithsimultaneousassessmentoflocomotoractivity.BrainResearchProtocols5,16-24(2000)；Lee,G.J.,Park,J.H.&Park,H.K.Microdialysisapplicationsinneuroscience.Neurologicalresearch30,661-668(2008))。除了生化方法外，利用化学氧化还原方法发展的电化学技术来检测单胺类神经递质如多巴胺、五羟色胺等是目前应用较多的检测神经递质释放的方法之一。该方法由于可以与电信号相偶联，其具有较好的灵敏度和时间分辨率，因此在了解多巴胺、五羟色胺等单胺类神经递质的释放及其调节机理的研究中起到了重要的作用(Zhou,Z.&Misler,S.Amperometricdetectionofstimulus-inducedquantalreleaseofcatecholaminesfromculturedsuperiorcervicalganglionneurons.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica92,6938-6942(1995)；Bruns,D.Detectionoftransmitterreleasewithcarbonfiberelectrodes.Methods(SanDiego,Calif.)33,312-321(2004))。然而，由于其插入的电极难以精确地靶定到特定突触位置，其实际上难以达到精确的细胞和亚细胞特异性，并且由于电极的插入等处理本身的因素，其对于组织和细胞具有一定的损伤性，不适合并行检测多处区域；另一方面，该方法为基于化学氧化还原原理开发，其只适用于单胺类神经递质，对于如乙酰胆碱等其他重要的神经递质的检测无能为力。虽然该方法在研究神经递质的功能和释放领域内起到了关键作用，其在现如今要求细胞特异和时空特异的神经生物学研究中作用越来越局限。应用光学成像的方法检测神经递质由于具有高灵敏性、实时观测的特点在近年来得到了快速发展。其中，美国旧金山大学圣地亚哥分校的DavidKleinfeld实验室开发的基于检测细胞系构建的神经递质检测方法CNiFERs，通过将改造过的人源HEK293细胞植入特定脑区实现对该脑区神经递质释放的检测(Muller,A.,Joseph,V.,Slesinger,P.A.&Kleinfeld,D.Cell-basedreportersrevealinvivodynamicsofdopamineandnorepinephrinereleaseinmurinecortex.Naturemethods11,1245-1252(2014)；Nguyen,Q.T.etal.Aninvivobiosensorforneurotransmitterreleaseandinsitureceptoractivity.Natureneuroscience13,127-132(2010))。该细胞系中具有特定神经递质所对应的G蛋白偶联受体，并在该受体下游偶联荧光钙指示剂，从而将神经递质的结合转变为细胞内钙信号的检测。该方法具有特异性的神经递质检测，在肾上腺素、多巴胺、乙酰胆碱的检测中起到了重要贡献。同时，其检测信号并非神经递质结合本身，而是下游经过级联方法的次级钙信号，使得该方法具有较高的灵敏性和秒级的时间分辨率。然而，由于其原理为移植外源细胞系进入大脑特定位置，其对内源神经细胞，对亚细胞轴突、树突甚至单个突触的水平神经递质作用的检测仍然难以进行。另一方面，其复杂的操作过程和可能的免疫排斥反应也限制了其在神经生物学领域的广泛应用。除去基于细胞的探针，分子层面上的神经递质探针也有所发展。瑞士洛桑理工大学的KaiJohnsson实验室开发了基于FRET原理的、用于检测乙酰胆碱的荧光探针ACh-SNIFIT(AlbertoSchena,etal,SensingAcetylcholineandanticholinesterasecompounds,AngewandteChemie,Vol53,Issue5,1302-1305,Dec13,2013)。相比于CNiFERs虽然体积很小便于操作，但ACh-SNIFIT的构建需要蛋白的表达和收集以及化学荧光基团的额外修饰，使用时需将其注射到相应脑区，不适合于神经递质在体的、无创伤的检测。可基因编码的、基于荧光蛋白构建的神经递质探针不仅可以具有细胞特异性的表达和检测，还可以通过优化荧光蛋白探针本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针，所述荧光探针是对G蛋白偶联受体进行改造获得的融合蛋白，所述改造包括在G蛋白偶联受体的第五跨膜区和第六跨膜区之间的第三胞内环中插入循环重排的荧光蛋白；所述基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针能够在细胞膜上表达；并且所述基于G蛋白偶联受体构建的的荧光探针当与所述G蛋白偶联受体的特异性配体接触时可以与其结合，由此导致荧光探针的荧光强度具有可检测到的变化。

【技术特征摘要】
1.基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针，所述荧光探针是对G蛋白偶联受体进行改造获得的融合蛋白，所述改造包括在G蛋白偶联受体的第五跨膜区和第六跨膜区之间的第三胞内环中插入循环重排的荧光蛋白；所述基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针能够在细胞膜上表达；并且所述基于G蛋白偶联受体构建的的荧光探针当与所述G蛋白偶联受体的特异性配体接触时可以与其结合，由此导致荧光探针的荧光强度具有可检测到的变化。2.权利要求1的荧光探针，其中所述改造包括对G蛋白偶联受体的第五跨膜区和第六跨膜区之间的第三胞内环截短并在截短的位置插入循环重排的荧光蛋白。优选地，其中所述循环重排的荧光蛋白两端分别通过连接肽与G蛋白偶联受体的第三胞内环相连；优选地，所述连接肽包括柔性氨基酸；更优选地，所述柔性氨基酸包括甘氨酸和/或丙氨酸；更优选地，所述连接肽由甘氨酸和丙氨酸组成；更优选地，所述循环重排的荧光蛋白N端的连接肽为GG，和/或循环重排的荧光蛋白C端的连接肽为GGAAA。还更优选地，其中所述循环重排的荧光蛋白选自循环重排的绿色荧光蛋白(cpGFP)、循环重排的黄色荧光蛋白(cpYFP)、循环重排的红色荧光蛋白(cpRFP)、循环重排的蓝色荧光蛋白(cpBFP)、循环重排的增强绿色荧光蛋白(cpEGFP)、循环重排的增强黄色荧光蛋白(cpEYFP)和循环重排的红外荧光蛋白(cpinfraredfluorescentprotein，cpiRFP)；优选地，所述循环重排的增强绿色荧光蛋白优选是来自GCaMP6s、GCaMP6m或G-GECO的cpEGFP；优选地，所述循环重排的红色荧光蛋白是cpmApple、cpmCherry、cpmRuby2、cpmKate2和cpFushionRed；优选地，所述cpmApple是来自R-GECO1的cpmApple；优选地，所述循环重排的黄色荧光蛋白包括但不限于循环重排的Venus(cpVenus)、循环重排的Citrin(cpCitrine)。3.权利要求1-2任一项的荧光探针，用循环重排的荧光素酶(cpluciferase)替代循环重排的荧光蛋白。优选地，其中所述G蛋白偶联受体是与特异性配体特异性结合的G蛋白偶联受体。优选地，其中所述特异性配体是神经递质、激素、代谢分子、营养分子、或人工合成的激活特定受体的小分子或药物；所述G蛋白偶联受体是与神经递质、激素、代谢分子、营养分子、或人工合成的激活特定受体的小分子或药物特异性结合的G蛋白偶联受体。更优选地，其中所述神经递质是肾上腺素、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、五羟色胺和/或多巴胺。更优选地，其中所述人工合成的激活特定受体的小分子或药物是异丙肾上腺素(ISO)。还更优选地，其中所述G蛋白偶联受体是人源的或动物源的。还更优选地，其中基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是用于检测肾上腺素的荧光探针，其中所述G蛋白偶联受体是特异性结合肾上腺素的GPCR。还更优选地，其中所述特异性结合肾上腺素的GPCR是人β2肾上腺素受体，所述基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是基于人β2肾上腺素受体构建的荧光探针。4.权利要求3的荧光探针，其中循环重排的荧光蛋白通过N端和C端的连接肽与人β2肾上腺素受体的第三胞内环相连；优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽的长度分别是氮端为1个或2个氨基酸，和/或碳端为1个、2个、3个、4个或5个氨基酸；优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽的长度分别是氮端为2个氨基酸，碳端为5个氨基酸；更优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为GGAAA，或者循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为SPSVA，或者循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为APSVA；或者优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽的长度分别是氮端为1个氨基酸，碳端为1个氨基酸；更优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为G，C端为G。还优选地，其中被插入到人β2肾上腺素受体中的循环重排的荧光蛋白是cpEGFP；优选地，所述cpEGFP是来自GCaMP6s、GCaMP6m或GECO1.2的cpEGFP。特别优选地，其中所述人β2肾上腺素受体的氨基酸序列为：MGQPGNGSAFLLAPNRSHAPDHDVTQQRDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTVTNYFITSLACADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTFGNFWCEFWTSIDVLCVTASIETLCVIAVDRYFAITSPFKYQSLLTKNKARVIILMVWIVSGLTSFLPIQMHWYRATHQEAINCYANETCCDFFTNQAYAIASSIVSFYVPLVIMVFVYSRVFQEAKRQLQKIDKSEGRFHVQNLSQVEQDGRTGHGLRRSSKFCLKEHKALKTLGIIMGTFTLCWLPFFIVNIVHVIQDNLIRKEVYILLNWIGYVNSGFNPLIYCRSPDFRIAFQELLCLRRSSLKAYGNGYSSNGNTGEQSGYHVEQEKENKLLCEDLPGTEDFVGHQGTVPSDNIDSQGRNCSTNDSLL(SEQIDNO:1)，其中下划线部分为第三胞内环；优选地：循环重排的荧光蛋白被插入到所述人β2肾上腺素受体的第240位氨基酸和第241位氨基酸之间；或者循环重排的荧光蛋白被插入到所述人β2肾上腺素受体的第250位氨基酸和第251位氨基酸之间。5.权利要求1-4任一项的荧光探针，其中基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是用于检测肾上腺素和/或去甲肾上腺素的荧光探针，其中所述G蛋白偶联受体是特异性结合肾上腺素和/或去甲肾上腺素的GPCR。优选地，其中所述特异性结合肾上腺素和/或去甲肾上腺素的GPCR是人ADRA2A受体，所述基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是基于人ADRA2A受体构建的荧光探针。还优选地，其中人ADRA2A受体的第三个胞内环被截短并在截短的位置插入循环重排的荧光蛋白。还优选地，循环重排的荧光蛋白通过N端和C端的连接肽与人ADRA2A受体的第三胞内环相连，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽的长度分别是氮端为2个氨基酸，碳端为5个氨基酸；优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为GGAAA，或者，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为TGAAA。还优选地，其中被插入到人ADRA2A受体中的循环重排的荧光蛋白是cpEGFP；优选地，所述cpEGFP是来自GCaMP6s、GCaMP6m或GECO1.2的cpEGFP。更优选地，其中所述人ADRA2A受体的氨基酸序列为：MFRQEQPLAEGSFAPMGSLQPDAGNASWNGTEAPGGGARATPYSLQVTLTLVCLAGLLMLLTVFGNVLVIIAVFTSRALKAPQNLFLVSLASADILVATLVIPFSLANEVMGYWYFGKAWCEIYLALDVLFCTSSIVHLCAISLDRYWSITQAIEYNLKRTPRRIKAIIITVWVISAVISFPPLISIEKKGGGGGPQPAEPRCEINDQKWYVISSCIGSFFAPCLIMILVYVRIYQIAKRRTRVPPSRRGPDAVAAPPGGTERRPNGLGPERSAGPGGAEAEPLPTQLNGAPGEPAPAGPRDTDALDLEESSSSDHAERPPGPRRPERGPRGKGKARASQVKPGDSLPRRGPGATGIGTPAAGPGEERVGAAKASRWRGRQNREKRFTFVLAVVIGVFVVCWFPFFFTYTLTAVGCSVPRTLFKFFFWFGYCNSSLNPVIYTIFNHDFRRAFKKILCRGDRKRIV(SEQIDNO:2)，其中下划线部分为第三胞内环；优选地：所述人ADRA2A受体的第三胞内环的第71-130位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白；或者，所述人ADRA2A受体的第三胞内环的第71-135位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白。6.权利要求1-5任一项的荧光探针，其中基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是用于检测乙酰胆碱的荧光探针，其中所述G蛋白偶联受体是特异性结合乙酰胆碱的GPCR。优选地，其中所述特异性结合肾上腺素的GPCR是人乙酰胆碱受体M3R亚型，所述基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是基于人乙酰胆碱受体M3R亚型构建的荧光探针。还优选地，其中人乙酰胆碱受体M3R亚型的第三个胞内环被截短并在截短的位置插入循环重排的荧光蛋白。还优选地，其中循环重排的荧光蛋白通过N端和C端的连接肽与人乙酰胆碱受体M3R亚型的第三胞内环相连；优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽的长度分别是氮端为2个氨基酸，碳端为5个氨基酸；更优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为GGAAA，或者，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为HGAAA，或者，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为HNAAA，或者，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为HNAK。还更优选地，其中被插入到人乙酰胆碱受体M3R亚型中的循环重排的荧光蛋白是cpEGFP；优选地，所述cpEGFP是来自GCaMP6s、GCaMP6m或GECO1.2的cpEGFP。更优选地，其中，所述人乙酰胆碱受体M3R亚型的氨基酸序列为：MTLHNNSTTSPLFPNISSSWIHSPSDAGLPPGTVTHFGSYNVSRAAGNFSSPDGTTDDPLGGHTVWQVVFIAFLTGILALVTIIGNILVIVSFKVNKQLKTVNNYFLLSLACADLIIGVISMNLFTTYIIMNRWALGNLACDLWLAIDYVASNASVMNLLVISFDRYFSITRPLTYRAKRTTKRAGVMIGLAWVISFVLWAPAILFWQYFVGKRTVPPGECFIQFLSEPTITFGTAIAAFYMPVTIMTILYWRIYKETEKRTKELAGLQASGTEAETENFVHPTGSSRSCSSYELQQQSMKRSNRRKYGRCHFWFTTKSWKPSSEQMDQDHSSSDSWNNNDAAASLENSASSDEEDIGSETRAIYSIVLKLPGHSTILNSTKLPSSDNLQVPEEELGMVDLERKADKLQAQKSVDDGGSFPKSFSKLPIQLESAVDTAKTSDVNSSVGKSTATLPLSFKEATLAKRFALKTRSQITKRKRMSLVKEKKAAQTLSAILLAFIITWTPYNIMVLVNTFCDSCIPKTFWNLGYWLCYINSTVNPVCYALCNKTFRTTFKMLLLCQCDKKKRRKQQYQQRQSVIFHKRAPEQAL(SEQIDNO:3)，其中下划线部分为第三胞内环；优选地：所述人乙酰胆碱受体M3R亚型的第260-490位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白；或者所述人乙酰胆碱受体M3R亚型的第260-491位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白。7.权利要求1-6任一项的荧光探针，其中基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是用于检测5-羟色胺的荧光探针，其中所述G蛋白偶联受体是特异性结合5-羟色胺的GPCR。优选地，其中所述特异性结合5-羟色胺的GPCR是人HTR2C受体，所述基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是基于人HTR2C受体构建的荧光探针。还优选地，其中人HTR2C受体的第三个胞内环被截短并在截短的位置插入循环重排的荧光蛋白。还优选地，循环重排的荧光蛋白通过N端和C端的连接肽与人HTR2C受体的第三胞内环相连；优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽的长度分别是氮端为2个氨基酸，碳端为5个氨基酸；更优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为GGAAA，或者，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为NG，C端为GFAAA。还更优选地，其中被插入到人HTR2C受体中的循环重排的荧光蛋白是cpEGFP；优选地，所述cpEGFP是来自GCaMP6s、GCaMP6m或GECO1.2的cpEGFP。特别优选地，其中，所述人HTR2C受体的氨基酸序列为：MVNLRNAVHSFLVHLIGLLVWQCDISVSPVAAIVTDIFNTSDGGRFKFPDGVQNWPALSIVIIIIMTIGGNILVIMAVSMEKKLHNATNYFLMSLAIADMLVGLLVMPLSLLAILYDYVWPLPRYLCPVWISLDVLFSTASIMHLCAISLDRYVAIRNPIEHSRFNSRTKAIMKIAIVWAISIGVSVPIPVIGLRDEEKVFVNNTTCVLNDPNFVLIGSFVAFFIPLTIMVITYCLTIYVLRRQALMLLHGHTEEPPGLSLDFLKCCKRNTAEEENSANPNQDQNARRRKKKERRPRGTMQAINNERKASKVLGIVFFVFLIMWCPFFITNILSVLCEKSCNQKLMEKLLNVFVWIGYVCSGINPLVYTLFNKIYRRAFSNYLRCNYKVEKKPPVRQIPRVAATALSGRELNVNIYRHTNEPVIEKASDNEPGIEMQVENLELPVNPSSVVSERISSV(SEQIDNO:4)，其中下划线部分为第三胞内环；优选地：所述人HTR2C受体的第三胞内环的第16-55位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白；或者，所述人HTR2C受体的第三胞内环的第11-60位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白；或者，所述人HTR2C受体的第三胞内环的第16-70位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白；或者，所述人HTR2C受体的第三胞内环的第15-68位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白；或者，所述人HTR2C受体的第三胞内环的第15-68位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白，并且其第三胞内环的第13位的亮氨酸L被突变为苯丙氨酸F。8.权利要求7的荧光探针，循环重排的荧光蛋白通过N端和C端的连接肽与人HTR2C受体的第三胞内环相连；优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽的长度分别是氮端为5个氨基酸，碳端为3个氨基酸；更优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为PVVSE，C端为ATR。优选地，其中被插入到人HTR2C受体中的循环重排的荧光蛋白是cpmApple；优选地，所述cpmApple是来自R-GECO1的cpmApple。还优选地，其中，所述人HTR2C受体的氨基酸序列为：MDPLNLSWYDDDLERQNWSRPFNGSDGKADRPHYNYYATLLTLLIAVIVFGNVLVCMAVSREKALQTTTNYLIVSLAVADLLVATLVMPWVVYLEVVGEWKFSRIHCDIFVTLDVMMCTASILNLCAISIDRYTAVAMPMLYNTRYSSKRRVTVMISIVWVLSFTISCPLLFGLNNADQNECIIANPAFVVYSSIVSFYVPFIVTLLVYIKIYIVLRRRRKRVNTKRSSRAFRAHLRAPLKGNCTHPEDMKLCTVIMKSNGSFPVNRRRVEAARRAQELEMEMLSSTSPPERTRYSPIPPSHHQLTLPDPSHHGLHSTPDSPAKPEKNGHAKDHPKIAKIFEIQTMPNGKTRTSLKTMSRRKLSQQKEKKATQMLAIVLGVFIICWLPFFITHILNIHCDCNIPPVLYSAFTWLGYVNSAVNPIIYTTFNIEFRKAFLKILHC(SEQIDNO:4)，其中下划线部分为第三胞内环；优选地：所述人HTR2C受体的第241-306位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白；或者，所述人HTR2C受体的第240-309位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白。9.权利要求1-8任一项的荧光探针，其中基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是用于检测多巴胺的荧光探针，其中所述G蛋白偶联受体是特异性结合多巴胺的GPCR。优选地，其中所述特异性结合多巴胺的GPCR是人DRD2受体，所述基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针是基于人DRD2受体构建的荧光探针。还优选地，其中人DRD2受体的第三个胞内环被截短并在截短的位置插入循环重排的荧光蛋白。还优选地，循环重排的荧光蛋白通过N端和C端的连接肽与人DRD2受体的第三胞内环相连；优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽的长度分别是氮端为2个氨基酸，碳端为5个氨基酸；更优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽分别是N端为GG，C端为GGAAA。还优选地，其中被插入到人DRD2受体中的循环重排的荧光蛋白是cpEGFP；优选地，所述cpEGFP是来自GCaMP6s、GCaMP6m或GECO1.2的cpEGFP。还更优选地，其中，所述人DRD2受体的氨基酸序列为：MDPLNLSWYDDDLERQNWSRPFNGSDGKADRPHYNYYATLLTLLIAVIVFGNVLVCMAVSREKALQTTTNYLIVSLAVADLLVATLVMPWVVYLEVVGEWKFSRIHCDIFVTLDVMMCTASILNLCAISIDRYTAVAMPMLYNTRYSSKRRVTVMISIVWVLSFTISCPLLFGLNNADQNECIIANPAFVVYSSIVSFYVPFIVTLLVYIKIYIVLRRRRKRVNTKRSSRAFRAHLRAPLKGNCTHPEDMKLCTVIMKSNGSFPVNRRRVEAARRAQELEMEMLSSTSPPERTRYSPIPPSHHQLTLPDPSHHGLHSTPDSPAKPEKNGHAKDHPKIAKIFEIQTMPNGKTRTSLKTMSRRKLSQQKEKKATQMLAIVLGVFIICWLPFFITHILNIHCDCNIPPVLYSAFTWLGYVNSAVNPIIYTTFNIEFRKAFLKILHC(SEQIDNO:5)，其中下划线部分为第三胞内环；优选地：所述人DRD2受体的第253-357位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白；或者，所述人DRD2受体的第254-360位氨基酸被截去，并在被截去的位置上插入循环重排的荧光蛋白。10.权利要求9的荧光探针，循环重排的荧光蛋白通过N端和C端的连接肽与人DRD2受体的第三胞内环相连；优选地，循环重排的荧光蛋白两端的连接肽的长度分别是氮端为5个氨基酸，碳端...

【专利技术属性】
技术研发人员：李毓龙，井淼，冯杰思，万金霞，王欢，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11