一种布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸制造技术

本发明专利技术涉及一种布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸，属于免疫学检测领域，包括卡壳和试纸条；卡壳包括相互扣合的卡盖和卡座；试纸条包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的吸水垫、检测垫、荧光微球垫1、荧光微球垫2和样品垫；其特征在于：所述检测垫为设有质控线C、检测线T1和检测线T2的硝酸纤维素膜，质控线C包被抗LPS多抗，检测线T1包被LPS抗原，检测线T2包被NH抗原；所述荧光微球垫1和荧光微球垫2为分别包埋时间分辨荧光微球标记的NH抗原和LPS抗原的玻璃纤维素膜。本发明专利技术为系统化、便捷化、规范化地检测布病S2疫苗免疫抗体和布病感染抗体提供一种新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸
本专利技术属于免疫学检测领域，具体涉及一种布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸。
技术介绍
布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是一种由布氏杆菌（Brucella）引起的人畜共患性全身传染病，与常见的病毒性动物疫病不同的是，该病病原体为胞内寄生菌，可在多种家畜体内存活。1985年，世界卫生组织（WHO）将布鲁氏菌分为6个种：羊、牛、猪、狗和鼠布氏杆菌，我国流行的主要是羊型布氏杆菌、牛型布氏杆菌和猪型布氏杆菌三种，其中羊布氏杆菌的致病力最强。布病主要侵害牛羊生殖器官和关节，引起母畜流产和公畜睾丸炎以及引发人的发热、关节肿痛和流产细菌性慢性传染病。近年来，随着我国畜牧养殖量不断增加，动物及其产品流通频繁，部分地区布病疫情呈持续上升势头，不仅严重危及人身健康和公共卫生安全，也势必影响畜牧业生产。布鲁氏菌的细胞膜分为三层，内层为细胞质膜，中层为外周胞质膜，外层为外膜，由脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMPs）和磷脂层构成。LPS和OMPs是主要的表面抗原，现有的常规血清学检测方法虽然具有较高的敏感性与特异性，但无法区分布鲁氏菌感染抗体和疫苗免疫抗体，进而影响防疫工作的效果，阻碍我国扑杀布病感染动物的政策的执行。研究发现，NH（Nativehapten，天然半抗原）蛋白位于光滑型布鲁氏菌表面，接种S2疫苗的动物血清中不能检出NH抗体，而野毒感染的动物血清中能够检出NH抗体，从而实现S2疫苗免疫抗体与野毒感染的鉴别。但是，如何运用现有理论开发一种能快速、准确、低成本地鉴别布鲁氏菌抗体仍是疾病防控的重大课题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸，包括活性材料制备、试纸制备及其检测方法，为系统化、便捷化、规范化地检测布病S2疫苗免疫抗体和布病感染抗体提供一种新方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸，包括卡壳和设在卡壳内的试纸条；卡壳包括相互扣合的卡盖和卡座；试纸条包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的吸水垫、检测垫、荧光微球垫1、荧光微球垫2和样品垫；卡盖上对应于检测垫的区域设有视窗，卡盖上对应于样品垫的区域设有加样孔，卡座内设有固定试纸条的卡槽；所述底板为不吸水的PVC板，吸水垫为吸水滤纸；其特征在于：所述检测垫为设有质控线C、检测线T1和检测线T2的硝酸纤维素膜，质控线C包被抗LPS多抗，检测线T1包被LPS抗原，检测线T2包被NH抗原；所述荧光微球垫1和荧光微球垫2为分别包埋时间分辨荧光微球标记的NH抗原和LPS抗原的玻璃纤维素膜；所述样品垫是经样品垫处理液浸泡处理后干燥的玻璃纤维素膜。作为对上述方案的进一步优化，所述NH抗原的制备方法，包括以下步骤：步骤一、向布鲁氏菌菌液中加入终浓度为0.5%的苯酚，37℃孵育48h进行灭活，得菌液试样；取菌液试样接种胰化大豆肉汤固体培养基平板，37℃培养10日，无菌生长，检验合格；步骤二、取经步骤一检验合格的菌液试样，离心弃上清，加入灭菌纯化水重悬洗涤，重复洗涤离心，得菌体沉淀；对菌体沉淀称重，按每20g菌体沉淀重悬于100ml灭菌纯化水中，得重悬菌液；将所得重悬菌液经120℃高压30min，8000r/min离心30min，取上清Ⅰ；将所取上清Ⅰ与乙醇以1:3的体积比混合，得混合溶液；将所得混合溶液-20℃孵育过夜，溶液5000r/min离心10min，取上清Ⅱ；将所取上清Ⅱ与乙醇1:2混合，然后-20℃孵育过夜，5000r/min离心10min，弃上清，得菌泥；步骤三、向将步骤二所得菌泥中加入灭菌纯化水重悬，再加入使终浓度均为50μg/ml的DNaseIItypeV和RNaseA，37℃孵育18h；加入终浓度为50μg/ml蛋白酶K，经55℃孵育1h后再于25℃孵育24h，重复处理至少3次，得处理后溶液；将所得处理后溶液经200000r/min超速离心6h，取上清并与苯酚以1:1的体积比混合，混合后经70℃孵育30min，再经8000r/min离心15min，去除水相得酚相；将酚相与乙醇以1:3的体积比混合，-20℃孵育过夜，5000r/min离心10min，取上清并与乙醇以1:4的体积比混合，-20℃孵育过夜，5000r/min离心10min，弃上清，灭菌纯化水重悬，即为粗提NH抗原；步骤四、将步骤三所得粗提NH抗原转入截留分子量为3kD的透析袋中进行透析，得纯化NH抗原。作为对上述方案的进一步优化，LPS抗原的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将布鲁氏菌菌液加热至80℃，维持90min后灭活，取样接种胰化大豆肉汤固体培养基（TSA）平板，37℃培养10日，无菌生长，检验合格；步骤二、取经步骤一检验合格的菌液，离心弃上清，得菌体沉淀；对菌体沉淀称重，按每50g菌体沉淀重悬于170ml灭菌纯化水中，加热至66℃，得重悬液；向重悬液中加入等体积的预热至66℃的体积分数为90%的苯酚水溶液，66℃持续搅拌20min，冷却至4℃，10000r/min离心15min，收集下层的酚相并用滤纸过滤，得滤液；步骤三、向步骤二所得滤液中加入含1%饱和醋酸钠溶液的冰冷甲醇溶液500ml，4℃沉淀2h，10000r/min离心15min，收集沉淀，用80ml灭菌纯化水重悬，4℃搅拌18h，10000r/min离心10min，收获上清液Ⅰ和沉淀Ⅰ，置4℃保存；将沉淀Ⅰ再重悬于80ml灭菌纯化水中，4℃搅拌2h，10000r/min离心10min，收集上清液Ⅱ；将上清液Ⅱ与上清液Ⅰ混合，即得粗提LPS抗原；步骤四、向步骤三所得粗提LPS抗原中加入8g三氯乙酸，搅拌10min后10000r/min离心取上清，用蒸馏水透析，4000ml/次，每次透析3h，透析4次；然后加入终浓度均为15μg/ml的DNaseI和RNaseA，37℃孵育24h；再加入终浓度为15μg/ml的蛋白酶K，55℃消化3h后再室温消化24h；用去离子水充分透析，从透析袋中取出抗原即得纯化LPS抗原。如权利要求1所述的布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸，其特征在于：所述质控线C、检测线T1和检测线T2是将包被液划膜于检测垫制得，其中，抗LPS多抗包被液的浓度为1.5mg/ml，NH抗原包被液的浓度为0.4mg/ml，LPS抗原包被液的浓度为0.4mg/ml。作为对上述方案的进一步优化，所述时间分辨荧光微球为直径200nm的含有高亮稀土染料的羧基聚苯乙烯微球。作为对上述方案的进一步优化，所述荧光微球垫是将荧光微球-抗原标记物溶液喷至玻璃纤维素膜上制得，所述荧光微球-抗原标记物溶液中，NH抗原的标记量是40μg/ml，LPS抗原的标记量是5μg/ml。本专利技术所述布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸的原理是双抗原夹心法测抗体：当待测样品为布鲁氏菌野毒感染阳性时，样品中同时含有NH抗体和LPS抗体，通过毛细作用带动荧光微球垫中的NH抗原标记物和LPS标记物向吸水垫一侧层析，途中与检测线（T1和T2）包被物均能发生特异性免疫反应；当待测样品为S2疫苗免疫阳性时，样品中仅含有LPS抗体，在层析过程中仅与检测线T2的LPS抗原包被物结合，从而实现对野毒抗体和免疫抗体的区分。反应结束后，用紫外光源对检测垫扫描，分布于检测线T1、检测线T2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸，包括卡壳和设在卡壳内的试纸条；卡壳包括相互扣合的卡盖和卡座；试纸条包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的吸水垫、检测垫、荧光微球垫1、荧光微球垫2和样品垫；卡盖上对应于检测垫的区域设有视窗，卡盖上对应于样品垫的区域设有加样孔，卡座内设有固定试纸条的卡槽；所述底板为不吸水的PVC板，吸水垫为吸水滤纸；其特征在于：所述检测垫为设有质控线C、检测线T1和检测线T2的硝酸纤维素膜，质控线C包被抗LPS多抗，检测线T1包被LPS抗原，检测线T2包被NH抗原；所述荧光微球垫1和荧光微球垫2为分别包埋时间分辨荧光微球标记的NH抗原和LPS抗原的玻璃纤维素膜；所述样品垫是经样品垫处理液浸泡处理后干燥的玻璃纤维素膜。

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸，包括卡壳和设在卡壳内的试纸条；卡壳包括相互扣合的卡盖和卡座；试纸条包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的吸水垫、检测垫、荧光微球垫1、荧光微球垫2和样品垫；卡盖上对应于检测垫的区域设有视窗，卡盖上对应于样品垫的区域设有加样孔，卡座内设有固定试纸条的卡槽；所述底板为不吸水的PVC板，吸水垫为吸水滤纸；其特征在于：所述检测垫为设有质控线C、检测线T1和检测线T2的硝酸纤维素膜，质控线C包被抗LPS多抗，检测线T1包被LPS抗原，检测线T2包被NH抗原；所述荧光微球垫1和荧光微球垫2为分别包埋时间分辨荧光微球标记的NH抗原和LPS抗原的玻璃纤维素膜；所述样品垫是经样品垫处理液浸泡处理后干燥的玻璃纤维素膜。2.如权利要求1所述的一种布鲁氏菌抗体血清学鉴别诊断试纸，其特征在于：所述NH抗原的制备方法，包括以下步骤：步骤一、向布鲁氏菌菌液中加入终浓度为0.5%的苯酚，37℃孵育48h进行灭活，得菌液试样；取菌液试样接种胰化大豆肉汤固体培养基平板，37℃培养10日，无菌生长，检验合格；步骤二、取经步骤一检验合格的菌液试样，离心弃上清，加入灭菌纯化水重悬洗涤，重复洗涤离心，得菌体沉淀；对菌体沉淀称重，按每20g菌体沉淀重悬于100ml灭菌纯化水中，得重悬菌液；将所得重悬菌液经120℃高压30min，8000r/min离心30min，取上清Ⅰ；将所取上清Ⅰ与乙醇以1:3的体积比混合，得混合溶液；将所得混合溶液-20℃孵育过夜，溶液5000r/min离心10min，取上清Ⅱ；将所取上清Ⅱ与乙醇1:2混合，然后-20℃孵育过夜，5000r/min离心10min，弃上清，得菌泥；步骤三、向将步骤二所得菌泥中加入灭菌纯化水重悬，再加入使终浓度均为50μg/ml的DNaseIItypeV和RNaseA，37℃孵育18h；加入终浓度为50μg/ml蛋白酶K，经55℃孵育1h后再于25℃孵育24h，重复处理至少3次，得处理后溶液；将所得处理后溶液经200000r/min超速离心6h，取上清并与苯酚以1:1的体积比混合，混合后经70℃孵育30min，再经8000r/min离心15min，去除水相得酚相；将酚相与乙醇以1:3的体积比混合，-20℃孵育过夜，5000r/min离心10min，取上清并与乙醇以1:4的体积比混合，-20℃孵育过夜，5000r/min离心10min，弃上清，灭菌纯化水重悬，即为粗提NH抗原；步骤四、将步骤三...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀梅，范伟兴，李凯，尼博，狄栋栋，原小燕，任雪建，吴彬，刘明瑞，杨志，肖利，侯志乾，王路，卫一新，
申请(专利权)人：洛阳现代生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41