一种液质联用测定血浆中呋塞米浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种液质联用测定血浆中呋塞米浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的混合有机溶剂进行萃取两次，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测。本发明专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为呋塞米的血药浓度测定提供依据；本方法的血浆标准曲线线性范围为10～2000ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％，适合于测定血浆中呋塞米的浓度。

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用测定血浆中呋塞米浓度的方法
本专利技术属于医药
，具体涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种液质联用测定血浆中呋塞米浓度的方法。
技术介绍
呋塞米是一个已知的化合物，具有如下结构：呋塞米又称速尿，化学名称：2-[(2-呋喃甲基)氨基]-5-(氨磺酰基)-4-氯苯甲酸，是作用于亨氏袢升支高效能利尿剂。临床上用于利尿药疗效不好而急需利尿的临床情况，可用于治疗充血性心力衰竭、肝硬化、和肾疾病引起的水肿，高血压，急性肺水肿或脑水肿，加速某些经肾消除的毒物排泄。目前，尚未关于呋塞米测定方法的文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种液质联用测定血浆中呋塞米浓度的方法，该方法可提高检测的速度、精度和灵敏度。为实现上述目的，一种测定血浆中呋塞米浓度的方法，血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：血浆以K2EDTA为抗凝剂，以呋塞米-d5为内标；于96深孔板中精密加入100uL的血浆样品，加入5uL的体积比为1：1的甲醇水溶液，混匀后加入5uL的1ng/uL的内标呋塞米-d5溶液，混匀后加入500uL的乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于20℃以3000rpm离心10min，取上层清液80uL至装有420uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：乙腈：甲酸按照体积比95：5：0.2混合得到的混合物，涡旋混匀，于20℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测；(2)试样测定：取10uL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中呋塞米和内标呋塞米-d5的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的呋塞米浓度；(3)液相色谱测定，条件为：色谱柱：AgilentZORBAXXDB-C18，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸/1M醋酸铵的体积百分比为100/0.2/0.1；流动相B：乙腈/水/甲酸/1M醋酸铵的体积百分比为80/20/0.2/0.1；洗液：乙腈/水的体积百分比为50/50；自动进样器温度为15℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间4min；(4)质谱测定，条件为：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为-4500V，雾化温度为480℃，喷雾气压力为20Psi，辅助加热气压力为20Psi，气帘气压力为20Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为-25eV的呋塞米和呋塞米-d5；碰撞室入口电压分别为-10eV的呋塞米和呋塞米-d5；碰撞电压分别为-20eV的呋塞米和呋塞米-d5；碰撞室出口电压分别为-10eV的呋塞米和呋塞米-d5；负离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z329.0→m/z285.0，其为呋塞米；和m/z334.0→m/z290.0，其为呋塞米-d5。优选的，所述步骤(3)中梯度洗脱的程序为：总时间(min)流动相A(％)流动相B(％)075250.575250.660401.560401.675251.975252.001002.501002.67525优选的，所述步骤(2)中，采用内标法，以呋塞米和内标呋塞米-d5的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的呋塞米的浓度。优选的，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：取100uL空白血浆10份置于96深孔板中，以贮备液的形式分别添加5uL浓度分别为0.2ng/μL、0.4ng/μL、1ng/μL、2ng/μL、10ng/μL、24ng/μL、30ng/μL、40ng/μL的呋塞米溶液至最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本中，分别添加5μl体积比为1：1的甲醇水溶液至空白样本和零浓度样本，混匀后分别向最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本、零浓度样本中加入5uL的1ng/uL的内标呋塞米-d5溶液，向空白样本中加入5uL的体积比为1：1的甲醇水溶液，混匀后分别向10份样本中加入500uL的乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于20℃以3000rpm离心10min，取上层清液80uL至装有420uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：乙腈：甲酸按照体积比95：5：0.2混合得到的混合物，涡旋混匀，于20℃以3000rpm离心5min后分别作为10份标准样品待检测；分别取10uL标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的呋塞米和内标呋塞米-d5的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的呋塞米的浓度。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)预处理方法简便，两步有机溶液萃取，适用于常规测定；(2)专属性强：在本实验所采用的色谱条件下，呋塞米保留时间为2.430min左右，内标呋塞米-d5保留时间在2.401min左右。呋塞米和内标呋塞米-d5的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；(3)灵敏度高：血浆最低定量限为10ng/mL，能准确测定血浆中呋塞米的浓度，灵敏度高，特异性强；(4)本专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为呋塞米的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为10～2000ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％。附图说明图1为HPLC-MS/MS法测得的呋塞米在人血浆中的标准曲线图；图2为人空白血浆的HPLC-MS/MS图；图3为人空白血浆加入呋塞米和呋塞米-d5的HPLC-MS/MS图；图4为健康受试者口服呋塞米药物后血浆样品再加入内标呋塞米-d5的HPLC-MS/MS图。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例：人类K2EDTA血浆中呋塞米浓度的测定一、实验材料与分析设备呋塞米(分析物)：中国食品药品检定研究院或相同、更高等级的标准品呋塞米-d5(内标)：TLCPharmaceuticalStandards或相同、更高等级的标准品使用试剂见下表1：表1试剂明细试剂名称级别制造商乙腈HPLCJ.T.Baker甲醇HPLCJ.T.Baker甲酸ACSAdamas醋酸铵HPLCJ.T.Baker注：亦可使用相同级别或更高级别的试剂使用分析设备见下表2：表2使用设备明细组件种类制造商Binarypump(二元泵)ACPumpABSCIEXDegasser(脱气器)DegasserABSCIEXColumnoven(恒温柱箱)ACColumnovenABSCIEXAutosampler(自动取样器)ACAutosamplerABSCIEXSamplerack(样本架)RackChangerABSCIEXMassspectrometer(质谱仪)TRIPLEQUADTM6500+ABSCIEXDataprocessor(数据处理器)Analyst1.6.3(software)ABSCIEX相同的LC/MS/MS系统亦可被使用。二、液质条件1、液相色谱条件色谱柱：AgilentZORBAXXDB-C18，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸/1M醋酸铵的体积百分比为100/0.2/0.1；流动相B：乙腈/水/甲酸/1M醋酸铵的体积百分比为80/20/0.2/0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液质联用测定血浆中呋塞米浓度的方法，其特征在于：血浆样品经预处理后经高效液相色谱‑串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：血浆以K2EDTA为抗凝剂，以呋塞米‑d5为内标；于96深孔板中精密加入100uL的血浆样品，加入5uL的体积比为1：1的甲醇水溶液，混匀后加入5uL的1ng/uL的内标呋塞米‑d5溶液，混匀后加入500uL的乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于20℃以3000rpm离心10min，取上层清液80uL至装有420uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：乙腈：甲酸按照体积比95：5：0.2混合得到的混合物，涡旋混匀，于20℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测；(2)试样测定：取10uL测试样品注入高效液相色谱‑串联质谱仪中，检测样品中呋塞米和内标呋塞米‑d5的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的呋塞米浓度；(3)液相色谱测定，条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX XDB‑C18，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸/1M醋酸铵的体积百分比为100/0.2/0.1；流动相B：乙腈/水/甲酸/1M醋酸铵的体积百分比为80/20/0.2/0.1；洗液：乙腈/水的体积百分比为50/50；自动进样器温度为15℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间4min；(4)质谱测定，条件为：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为‑4500V，雾化温度为480℃，喷雾气压力为20Psi，辅助加热气压力为20Psi，气帘气压力为20Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为‑25eV的呋塞米和呋塞米‑d5；碰撞室入口电压分别为‑10eV的呋塞米和呋塞米‑d5；碰撞电压分别为‑20eV的呋塞米和呋塞米‑d5；碰撞室出口电压分别为‑10eV的呋塞米和呋塞米‑d5；负离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z329.0→m/z285.0，其为呋塞米；和m/z334.0→m/z290.0，其为呋塞米‑d5。...

【技术特征摘要】
1.一种液质联用测定血浆中呋塞米浓度的方法，其特征在于：血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：血浆以K2EDTA为抗凝剂，以呋塞米-d5为内标；于96深孔板中精密加入100uL的血浆样品，加入5uL的体积比为1：1的甲醇水溶液，混匀后加入5uL的1ng/uL的内标呋塞米-d5溶液，混匀后加入500uL的乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于20℃以3000rpm离心10min，取上层清液80uL至装有420uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：乙腈：甲酸按照体积比95：5：0.2混合得到的混合物，涡旋混匀，于20℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测；(2)试样测定：取10uL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中呋塞米和内标呋塞米-d5的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的呋塞米浓度；(3)液相色谱测定，条件为：色谱柱：AgilentZORBAXXDB-C18，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸/1M醋酸铵的体积百分比为100/0.2/0.1；流动相B：乙腈/水/甲酸/1M醋酸铵的体积百分比为80/20/0.2/0.1；洗液：乙腈/水的体积百分比为50/50；自动进样器温度为15℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间4min；(4)质谱测定，条件为：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为-4500V，雾化温度为480℃，喷雾气压力为20Psi，辅助加热气压力为20Psi，气帘气压力为20Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为-25eV的呋塞米和呋塞米-d5；碰撞室入口电压分别为-10eV的呋塞米和呋塞米-d5；碰撞电压分别为-20eV的呋塞米和呋塞米-d5；碰撞室出口电压分别为-10eV的呋塞米和呋塞米-d5；负离子方式检测；扫描方式为多重反...

【专利技术属性】
技术研发人员：林明弘，
申请(专利权)人：徐州佳生医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32