多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方法和质谱分析方法技术

本发明专利技术公开了多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方法和质谱分析方法，包括多种氨基酸和肉碱释放剂检测的前处理方法与多种氨基酸和肉碱释放剂检测的质谱分析方法，多种氨基酸和肉碱释放剂检测的前处理方法，本发明专利技术涉及生物成份检测技术领域。该多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方法和质谱分析方法，可实现在采用质谱技术进行生物病理检测时，避免样本分类混乱的情况发生，大大增强了前处理效果，保证了后期的质谱检测精度，同时可大大提高质谱设备的分析精确度，防止得到的质谱图像模糊不够准确，很好的实现了通过对质谱图进行平滑算法处理，使质谱图能够清晰的体现出来，从而大大方便了相关人员的生物成份质谱检测工作。

【技术实现步骤摘要】
多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方法和质谱分析方法
本专利技术涉及生物成份检测
，具体为多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方法和质谱分析方法。
技术介绍
生物检测是近年来高速发展的学科之一，其概念和范围也在不断变化，狭义的生物检测技术是利用生物体对被检测物质的特有反应而鉴定被检物质的质量和功效的方法，其所用生物体主要是各种微生物和某些动物，检测的范围主要是生物效价测定和安全性的试验，生物检测是以现代生物工程技术为核心，阐述生物过程及产品的理化及功能的分析检测手段和方法，如基因及基因组学、蛋白及蛋白组学、次生产物有效成分、酶、细胞、功效及毒理和代谢的分析检测，具有较强的集成性和实用性，生物质谱技术正成为蛋白质鉴定分析的主要支撑技术，它通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析，双向凝胶电泳分离的蛋白质点数目多、量少，其鉴定方法是利用蛋白质的各种属性参数如相对分子质量、等电点、序列、氨基酸组成、肽质量指纹谱等在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质，若在数据库中找不到，有可能是发现了新蛋白质，要进行序列分析，进一步合成DNA探针来表达、分离和鉴定它。目前在采用质谱技术进行生物病理检测时，样本分类较为混乱，且前处理效果较差，给后期的质谱检测带来了极大的不便，不能实现通过对每个待处理的样本进行标记来确认样本类型，无法达到通过氮吹和复溶来加强样本的前处理效果，同时现有的质谱分析精确度较低，得到的质谱图像模糊不够准确，不能实现通过对质谱图进行平滑算法处理，使质谱图能够清晰的体现出来，从而给相关人员的生物成份质谱检测工作带来了极大的不便。专利技术内容(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方法和质谱分析方法，解决了目前在采用质谱技术进行生物病理检测时，样本分类较为混乱，且前处理效果较差，给后期的质谱检测带来了极大的不便，同时现有的质谱分析精确度较低，得到的质谱图像模糊不够准确的问题。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方法和质谱分析方法，包括多种氨基酸和肉碱释放剂检测的前处理方法与多种氨基酸和肉碱释放剂检测的质谱分析方法，所述多种氨基酸和肉碱释放剂检测的前处理方法，具体包括以下步骤：S1、提取液的制备和标记：首先将经确认的待测样本、释放剂NBS－X1、释放剂NBS－F3、内标液和质控品取出放置23-27℃室温内，并混匀，然后取内标液1ml，加入99ml释放剂NBS－X1混匀，即可得到得提取液，之后将96孔蛋白过滤板和平底板A排朝上，在蛋白过滤板靠近H排的侧面及平底板的背面用记号笔标注检测日期及板号，并在平底板近H排的侧面用记号笔划线做标记；S2、打孔取样提取：用Φ3.0mm打孔器在样本干血片的血斑中心上打孔取样，用一次性注射针头将3mm血斑放置于蛋白过滤板底部，按空白样、质控品Z1和Z2、待测样顺序依次进行放置，然后在蛋白过滤板内的质控样和待测样中分别加入提取液100μl，之后用封板塑料膜密封蛋白过滤板后，放入微孔板恒温振荡器中在室温和500rpm条件下，振摇30min；S3、离心过滤和氮吹：将密封的蛋白过滤板与下层匹配的平底板一起放置在96孔板离心机中，对称摆放，在4000rpm条件下，离心5min，然后打开氮气瓶阀，调节气瓶分压阀至分压在0.3-0.4MPa，将氮吹仪吹气口面旋转90°，调节氮吹仪压力阀使转子上缘至刻度为40LPM，将平底板平稳放在氮吹仪台面上，将氮吹仪吹气口面旋转至正对平底板，缓慢调节使氮吹仪台面上升至氮吹仪出气口略微伸入平底板，10min后略向上调整氮吹仪台面，20min后将平底板取出，用手电筒光从平底板底部照射，仔细观察平底板内有无液体，致平底孔板内无液体后停止氮吹；S4、衍生化反应：从冰箱中取出释放剂NBS－Z2，混匀，在平底板内的质控样和待测样中分别加入50μl释放剂NBS－Z2，在平底板上用封板铝膜密封后，放入微孔板恒温振荡器在60℃和600rpm条件下，振摇衍生30min；S5、氮吹、复溶和离心：揭去封板铝膜，设置氮吹仪温度至60℃，打开氮气瓶阀，调节氮吹仪分压表压力调至0.02Mpa，将平底板平稳放在氮吹仪台面上，缓慢调节使氮吹仪出气口略微深入平底板，15min后将平底板取出，用手电筒光从平底板底部照射，仔细观察平底板内有无液体，至平底板内无水渍后停止氮吹，在平底板内的空白样、质控样和待测样中分别加入100μl释放剂NBS－F3，用锡箔纸密封后放入微孔板恒温振荡器在室温和500rpm的条件下，振摇10min，之后将密封的平底板放置在96孔板离心机中，对称摆放，在4000rpm条件下，离心5min，即可完成检测前处理；S6、测试后整理：将测试后剩余待测样装入自封袋内并在袋外贴标签注明检测项目、检测日期及检品数量后放入冰箱冷藏保存，将测试后剩余试剂及质控品放回冰箱冷藏保存，超声清洗氮吹仪针头，最后将移液枪挂于移液器架，补齐枪头盒内的枪头，清理实验台桌面。优选的，所述多种氨基酸和肉碱释放剂检测的质谱分析方法，具体包括以下步骤：T1、质量自动校准：首先打开与质谱仪对于的检测软件，并将质谱仪与计算机进行连机，然后根据校准目标选择相应的打开方式，之后将质谱参数设置在系统内，然后把配好的质量校准溶液吸入针筒内，开针泵进行连续进样，然后采集PPG标准品质谱数据，之后对数据进行自动优化；T2、离子源TIS连接液相调节：首先将S1-S6得到的前处理检测样品稀释10-100倍，作为优化用样品，然后分别将自动进样器、液相色谱泵和TIS离子源连接好，先调偏离子源，使喷口远离气帘气挡板中心孔，然后启动泵开始工作，在离子源一不加温、二不开加热辅助气的条件下，调节离子源喷口，使液滴在气溶气挡板上溅开线边缘距气帘气挡板中心孔边缘至少2-3mm，即可完成离子源的调节工作；T3、质量分析检测：启动离子泵将离子源内的样品离子泵入质量分析器内，并通过检测器进行离子检测，可通过质量分析器内部的四级杆分析结构进行分析处理；T4、检测结果的定性和定量分析：通过计算机将T3检测器检测的数据进行定性和定量分析，通过计算机软件绘制的各个成份的质谱图，来观察各个离子的情况，同时通过数据平滑处理算法使每一个数据点被其前后数据点的平均值代替，平滑后的数据组代替了以前的数据组，因此数据可进行多次平滑处理，即可得到多种氨基酸和肉碱释放剂检测样品中各个成份的含量数据情况。优选的，所述步骤T1中对于不同仪器测定极性，要用不同的质量校准溶液，对于负离子校准，针泵流速为10uL/min，需用稀释10倍的PPG3000标准溶液，而对于正离子校准，针泵流速为510uL/min，需用稀释50倍的PPG标准溶液。优选的，所述步T3中四级杆分析结构在工作时，可在棒状电极上加一个直流电压和一个射频电压，两对电极之间的电位相反，对于给定的直流和射频电压，只有特定质荷比的离子能够通过并到达检测器，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭，通过改变直流电压或射频电压,可实现质谱扫描。优选的，所述步骤S1禁止将已放入孔板中的样本取出重新放入其它位置，且步骤S2在打孔制样的操作中，一次性打孔数不得超过12个，每放置完一排样本后，清理桌面，再继续下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方法和质谱分析方法，包括多种氨基酸和肉碱释放剂检测的前处理方法与多种氨基酸和肉碱释放剂检测的质谱分析方法，其特征在于：所述多种氨基酸和肉碱释放剂检测的前处理方法，具体包括以下步骤：S1、提取液的制备和标记：首先将经确认的待测样本、释放剂NBS－X1、释放剂NBS－F3、内标液和质控品取出放置23‑27℃室温内，并混匀，然后取内标液1ml，加入99ml释放剂NBS－X1混匀，即可得到得提取液，之后将96孔蛋白过滤板和平底板A排朝上，在蛋白过滤板靠近H排的侧面及平底板的背面用记号笔标注检测日期及板号，并在平底板近H排的侧面用记号笔划线做标记；S2、打孔取样提取：用Φ3.0mm打孔器在样本干血片的血斑中心上打孔取样，用一次性注射针头将3mm血斑放置于蛋白过滤板底部，按空白样、质控品Z1和Z2、待测样顺序依次进行放置，然后在蛋白过滤板内的质控样和待测样中分别加入提取液100μl，之后用封板塑料膜密封蛋白过滤板后，放入微孔板恒温振荡器中在室温和500rpm条件下，振摇30min；S3、离心过滤和氮吹：将密封的蛋白过滤板与下层匹配的平底板一起放置在96孔板离心机中，对称摆放，在4000rpm条件下，离心5min，然后打开氮气瓶阀，调节气瓶分压阀至分压在0.3‑0.4MPa，将氮吹仪吹气口面旋转90°，调节氮吹仪压力阀使转子上缘至刻度为40LPM，将平底板平稳放在氮吹仪台面上，将氮吹仪吹气口面旋转至正对平底板，缓慢调节使氮吹仪台面上升至氮吹仪出气口略微伸入平底板，10min后略向上调整氮吹仪台面，20min后将平底板取出，用手电筒光从平底板底部照射，仔细观察平底板内有无液体，致平底孔板内无液体后停止氮吹；S4、衍生化反应：从冰箱中取出释放剂NBS－Z2，混匀，在平底板内的质控样和待测样中分别加入50μl释放剂NBS－Z2，在平底板上用封板铝膜密封后，放入微孔板恒温振荡器在60℃和600rpm条件下，振摇衍生30min；S5、氮吹、复溶和离心：揭去封板铝膜，设置氮吹仪温度至60℃，打开氮气瓶阀，调节氮吹仪分压表压力调至0.02Mpa，将平底板平稳放在氮吹仪台面上，缓慢调节使氮吹仪出气口略微深入平底板，15min后将平底板取出，用手电筒光从平底板底部照射，仔细观察平底板内有无液体，至平底板内无水渍后停止氮吹，在平底板内的空白样、质控样和待测样中分别加入100μl释放剂NBS－F3，用锡箔纸密封后放入微孔板恒温振荡器在室温和500rpm的条件下，振摇10min，之后将密封的平底板放置在96孔板离心机中，对称摆放，在4000rpm条件下，离心5min，即可完成检测前处理；S6、测试后整理：将测试后剩余待测样装入自封袋内并在袋外贴标签注明检测项目、检测日期及检品数量后放入冰箱冷藏保存，将测试后剩余试剂及质控品放回冰箱冷藏保存，超声清洗氮吹仪针头，最后将移液枪挂于移液器架，补齐枪头盒内的枪头，清理实验台桌面。...

【技术特征摘要】
1.多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方法和质谱分析方法，包括多种氨基酸和肉碱释放剂检测的前处理方法与多种氨基酸和肉碱释放剂检测的质谱分析方法，其特征在于：所述多种氨基酸和肉碱释放剂检测的前处理方法，具体包括以下步骤：S1、提取液的制备和标记：首先将经确认的待测样本、释放剂NBS－X1、释放剂NBS－F3、内标液和质控品取出放置23-27℃室温内，并混匀，然后取内标液1ml，加入99ml释放剂NBS－X1混匀，即可得到得提取液，之后将96孔蛋白过滤板和平底板A排朝上，在蛋白过滤板靠近H排的侧面及平底板的背面用记号笔标注检测日期及板号，并在平底板近H排的侧面用记号笔划线做标记；S2、打孔取样提取：用Φ3.0mm打孔器在样本干血片的血斑中心上打孔取样，用一次性注射针头将3mm血斑放置于蛋白过滤板底部，按空白样、质控品Z1和Z2、待测样顺序依次进行放置，然后在蛋白过滤板内的质控样和待测样中分别加入提取液100μl，之后用封板塑料膜密封蛋白过滤板后，放入微孔板恒温振荡器中在室温和500rpm条件下，振摇30min；S3、离心过滤和氮吹：将密封的蛋白过滤板与下层匹配的平底板一起放置在96孔板离心机中，对称摆放，在4000rpm条件下，离心5min，然后打开氮气瓶阀，调节气瓶分压阀至分压在0.3-0.4MPa，将氮吹仪吹气口面旋转90°，调节氮吹仪压力阀使转子上缘至刻度为40LPM，将平底板平稳放在氮吹仪台面上，将氮吹仪吹气口面旋转至正对平底板，缓慢调节使氮吹仪台面上升至氮吹仪出气口略微伸入平底板，10min后略向上调整氮吹仪台面，20min后将平底板取出，用手电筒光从平底板底部照射，仔细观察平底板内有无液体，致平底孔板内无液体后停止氮吹；S4、衍生化反应：从冰箱中取出释放剂NBS－Z2，混匀，在平底板内的质控样和待测样中分别加入50μl释放剂NBS－Z2，在平底板上用封板铝膜密封后，放入微孔板恒温振荡器在60℃和600rpm条件下，振摇衍生30min；S5、氮吹、复溶和离心：揭去封板铝膜，设置氮吹仪温度至60℃，打开氮气瓶阀，调节氮吹仪分压表压力调至0.02Mpa，将平底板平稳放在氮吹仪台面上，缓慢调节使氮吹仪出气口略微深入平底板，15min后将平底板取出，用手电筒光从平底板底部照射，仔细观察平底板内有无液体，至平底板内无水渍后停止氮吹，在平底板内的空白样、质控样和待测样中分别加入100μl释放剂NBS－F3，用锡箔纸密封后放入微孔板恒温振荡器在室温和500rpm的条件下，振摇10min，之后将密封的平底板放置在96孔板离心机中，对称摆放，在4000rpm条件下，离心5min，即可完成检测前处理；S6、测试后整理：将测试后剩余待测样装入自封袋内并在袋外贴标签注明检测项目、检测日期及检品数量后放入冰箱冷藏保存，将测试后剩余试剂及质控品放回冰箱冷藏保存，超声清洗氮吹仪针头，最后将移液枪挂于移液器架，补齐枪头盒内的枪头，清理实验台桌面。2.根据权利要求1所述的多种氨基酸和肉碱释放剂检测前处理方...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏磊，
申请(专利权)人：扬州诺明哲天医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32