本发明专利技术公开了一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，主要包括：基因组DNA提取、抗感品种的PCR片段克隆、抗性基因特异性引物的设计；HRM（高分辨率熔解曲线）反应体系等步骤。最后利用LightCycler®480的Gene Scanning 1.5 version软件进行高分辨率熔解曲线分析。通过该方法能科学高效准确地检测出番茄灰叶斑的抗性基因。
【技术实现步骤摘要】
一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法
本专利技术提供一种快速、简捷、高效的番茄灰叶斑抗性基因的方法，属植物保护领域。
技术介绍
近年来随着设施番茄栽培面积的不断扩大、频繁引进国外品种及主栽品种的更换，使得灰叶斑病在一些番茄种植基地流行为害逐年偏重。目前在生产上推广的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄品种很多都表现出对灰叶斑病的高度感病性，且感病后发病速度快，严重影响植物的光合作用并减少营养物质的合成，甚至造成全株死亡；又由于该病是新发展起来的病害，农户普遍缺乏防治经验，加之生产上缺乏有效的防控措施，时常发生误诊或防治不及时，导致番茄减产或绝收，给农户造成严重的经济损失。因此，积极开展灰叶斑病抗性鉴定工作和抗病育种研究工作，对减少该病害具有重要意义。前人已经对灰叶斑的抗性遗传规律及分子标记进行了一些研究。2009年JiandScott报道了一个能够检测Sm基因的Caps标记CT55，该标记是一个隐性标记，PCR产物约为400bp，经DdeI酶切后，感病材料和杂合材料产生330bp、200bp和140bp左右的条带，而抗病材料中产生200bp和140bp的条带，该标记不能区分感病材料与杂合材料，且其尚未在番茄种质资源中验证应用。高建昌等人专利技术开发了一个与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记，利用PCR技术对该标记位点进行扩增，通过电泳检测扩增产物的片段数量和大小，判断被检番茄样品是否为抗灰叶斑病材料。这种方法也有一些弊端，因抗病材料和感病材料只相差12个碱基，普通的凝胶电泳很难区分来，在实际应用中常出现误判的现象。本研究就是在高建昌等人的标记基础上，利用HRM方法开发出一种操作简单易于区分的分子标记方法来检测番茄灰叶斑的抗性基因。该方法不需PCR、酶切和电泳，只需利用HRM曲线就可检测出番茄灰叶斑的抗性基因。本方法可加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。
技术实现思路
目前番茄灰叶斑的抗性基因检测方法中需要进行PCR和限制性内切酶酶切等步骤。针对该方法检测时间太长且结果容易误判等问题，专利技术人进行了大量的研究工作，通过基因克隆和测序确定了抗感品种中的基因差异，利用HRM方法建立了番茄灰叶斑的抗性基因的检测体系。此方法无酶切、操作简单是一种简单方便的番茄灰叶斑的抗性基因检测的新方法。本专利技术旨在提供一种简便的抗性基因检测方法，通过该方法能科学高效准确地检测出番茄灰叶斑的抗性基因。为实现上述目的，本专利技术公开了的如下的
技术实现思路
：一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行（1）基因组DNA提取：（2）抗感品种的PCR片段克隆：利用Sm-Indel-F/R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA20-60ng，TaqDNA聚合酶0.5U，dNTPs(each10mmol/L)0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L）2.5μL。PCR反应条件为：95℃热启动之后，进行PCR扩增。循环条件为：95℃变性5min，95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，72℃过度延伸10min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆；所述的引物指的是：Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。（3）抗性基因特异性引物的设计因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计等位基因特异性的引物；（4）HRM（高分辨率熔解曲线）反应体系PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析在荧光定量PCR仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA20-60ng，premix10uL,20×Evagreen1uL，5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L）0.4μL，PCR扩增程序：95℃预变性10min，然后按95℃变性10min，55℃退火15s，72℃延伸10s进行45个循环，扩增产物HRM检测程序为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，在65℃升温至95℃的过程中，以25次·-1℃的频率收集荧光信息，最后降温至40℃，利用LightCycler®480的GeneScanning1.5version软件进行高分辨率熔解曲线分析；所述的引物指的是：Smhrm2F：GATCTCATCCCGTTGTATATGCSmhrm2RGCAAAGACATGACTAAACTCT。本专利技术进一步公开了所述的鉴定番茄灰叶斑抗性基因方法在加快抗病材料和品种选育速度方面的应用。实验结果证明：本专利技术的方法能有效区分出番茄对灰叶斑的抗感性，可用于抗灰叶斑的分子标记育种，加快抗病材料和品种选育速度。本专利技术主要解决了现有番茄灰叶斑抗性基因检测方法不易判断的问题，重点考察了抗病品种和感病品种的基因序列特征，主要的难点在于针对基因序列特片设计出能够区分抗感品种的HRM引物及相应的反应体系，使番茄灰叶斑的抗性基因和感病基因得以明显的判断。本专利技术更加详细的描述如下主要步骤：1.1材料抗病纯合：欧旺（天津朝研种苗科技有限公司）的高代自交系J-6，由天津市农业生物技术研究中心保存。感病纯合：Moneymaker,由天津市农业生物技术研究中心保存。杂合型：3110（J-6×Moneymaker获得的F1代）。市售商品种：市售商品种：1（圣迪）、2（欧旺）、340（秋盛）、罗拉（341）、213（津杂213）。1.2方法1.2.1基因组DNA提取参考毛国杰等(2001)的方法。1．2．2Indel和的验证根据高等人设计的1对引物，用于标记基因片段的扩增（抗病型为158bp;感病型为170bp）。引物序列分别为：Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG。1.2.3抗感品种的PCR片段克隆利用Sm-Indel-F/R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA20-60ng，TaqDNA聚合酶0.5U，dNTPs(each10mmol/L)0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L）2.5μL。PCR反应条件为：95℃热启动之后，进行PCR扩增。循环条件为：95℃变性5min，95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，72℃过度延伸10min。将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增（MJPTC-200）。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。采用奥莱博有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆。在Takara公司进行测序。1.2.4抗性基因特异性引物的设计因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计等位基因特异性的引物。为了在不同材料中检测目标SNP，采用HRM方法（高分辨率本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行:（1）基因组DNA提取； （2）抗感品种的PCR片段克隆：利用Sm‑Indel‑F /R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA 20‑60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10 µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L ）2.5μL；PCR反应条件为： 95℃热启动之后，进行PCR扩增；循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆；所述的引物指的是：Sm‑Indel‑F:GATCTCATCCCGTTGTATATG ；Sm‑Indel‑R:CACCCACAAACAAATCAAG；（3）抗性基因特异性引物的设计因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间一定存在一个或几个SNP（单核苷酸多态性），根据测序结果设计HRM特异性的引物；（4） HRM反应体系PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在荧光定量PCR 仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA 20‑60 ng，premix 10uL,20×Evagreen 1uL，5，端引物（10µmol/L）0.4μL，3，端引物（10µmol/L ）0.4μL，PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s 进行45 个循环，扩增产物HRM 检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95 ℃的过程中，以25 次 ·‑1 ℃的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃，利用LightCycler®480 的Gene Scanning 1.5 version 软件进行高分辨率熔解曲线分析；所述的引物指的是：Smhrm2F：GATCTCATCCCGTTGTATATGCSmhrm2R GCAAAGACAT GACTAAACTCT。...
【技术特征摘要】
1.一种鉴定番茄灰叶斑抗性基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行:（1）基因组DNA提取；（2）抗感品种的PCR片段克隆：利用Sm-Indel-F/R引物，对抗病品种和感病品种进行PCR扩增，反应总体积为25μL，包括模板DNA20-60ng，TaqDNA聚合酶0.5U，dNTPs(each10mmol/L)0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5，端引物（10µmol/L）2.5μL，3，端引物（10µmol/L）2.5μL；PCR反应条件为：95℃热启动之后，进行PCR扩增；循环条件为：95℃变性5min，95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，72℃过度延伸10min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将其进行连接、转化后，挑取阳性克隆；所述的引物指的是：Sm-Indel-F:GATCTCATCCCGTTGTATATG；Sm-Indel-R:CACCCACAAACAAATCAAG；（3）抗性基因特异性引物的设计因为感病品种存在PCR产物大小不同，所以在抗感品种间...
【专利技术属性】
技术研发人员：金凤媚，宋建，薛俊，孙海波，
申请(专利权)人：天津市农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：天津,12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。