一种新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新kappa‑卡拉胶寡糖单体的制备方法，属于海藻寡糖提取技术领域。具体步骤如下：（1）制备卡拉胶酶解液；（2）酶解法降解kappa‑卡拉胶制备卡拉胶寡糖；（3）将酶解制得的新kappa‑卡拉胶寡糖溶解后微孔滤膜过滤，用Bio‑Gel‑P6fine凝胶柱进行分离，按洗脱峰合并收集，浓缩，然后冷冻干燥，共得新kappa‑卡拉胶二糖至十四糖7种单体寡糖。本发明专利技术采用酶法降解，使得制备过程简单快捷、条件温和产物得率高、质量稳定，能够一次性得到新kappa‑卡拉胶二糖至十四糖，弥补了现有技术的不足，特别是可以提供高聚合度kappa‑卡拉胶寡糖的标准品，即新kappa‑卡拉胶十糖至十四糖，可为构效关系和应用研究提供足量的高纯度新kappa‑卡拉胶寡糖单体。

【技术实现步骤摘要】
一种新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法
本专利技术涉及一种新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法，尤其涉及一次性得到新kappa-卡拉胶二糖至十四糖的制备方法，属于海藻寡糖提取

技术介绍
卡拉胶作为一种结构独特的天然海洋硫酸多糖，被称为类肝素多糖，其生物活性已经成为当前多糖研究领域中的一个热点。近年来，卡拉胶在生理学和病理学研究中所显出来的生物活性已相继被人们发现。实验研究显示，卡拉胶具有抗血管新生、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血糖等生物学活性。但由于卡拉胶多糖分子量较大，溶解性和吸收性较差，结构复杂等原因，限制了其应用。而卡拉胶寡糖分子量较小，溶解性增强，结构简化，易于吸收，稳定性和安全性都有所增加，多糖链经过不同形式的断裂后活性基团充分暴露，其活性较卡拉胶有显著提高，同时寡糖还具有低毒性的特征，因此拓宽了卡拉胶的应用范围，目前卡拉胶寡糖活性的研究已日益受到关注。卡拉胶寡糖是从红藻细胞壁中提取得到的一种水溶性硫酸寡糖，主要存在于红藻纲的角叉菜属（Chondrus）、杉藻属（Gigartina）、麒麟菜属（Eucheuma）和沙菜属中。卡拉胶寡糖的基本结构是由β(1→3)-D-吡喃半乳糖（G）和α(1→4)-D-吡喃半乳糖(D)为基本骨架交替连接形成的硫酸线性寡糖。根据是否含有3，6-内醚半乳糖以及半乳糖上的硫酸基团的含量和分子中半乳糖所连接的位置不同，卡拉胶寡糖可分为八种类型：kappa-卡拉胶寡糖、γ-卡拉胶寡糖、ι-卡拉胶寡糖、ω-卡拉胶寡糖、λ-卡拉胶寡糖、υ-卡拉胶寡糖、ψ-卡拉胶寡糖、ξ-卡拉胶寡糖。常用的卡拉胶寡糖主要有κ-、ι-、λ-型。目前卡拉胶寡糖的制备主要有化学降解、物理降解和酶降解三种方法。化学和物理降解方法存在反应条件不易控制、降解产物不均一等缺点，在工业生产中受到限制，而酶降解法可以最大程度地保护反应底物的活性基团不会在降解过程中受到破坏，降解产物均一，反应条件温和，产物活性较高。如专利201710291565.3公开了一种k-卡拉胶寡糖单体快速分离纯化的方法，通过生物降解法降解卡拉胶寡糖底物容物，并采用闪式中低压制备色谱快速分离纯化寡糖单体，可获得四种k-卡拉胶寡糖单体，寡糖总量得率为5%；专利03138968.6公开了一种k-卡拉胶寡糖单体及其制备方法，一次分离即可得到聚合度为7－25的所有奇数K－卡拉胶寡糖，无需再用离子交换色谱法进一步分离，大大简化了工艺操作和提高了寡糖的制备效率。但现有技术中只有新kappa-卡拉胶二糖至八糖制备方法，并无高聚合度偶数卡拉胶寡糖的报告和记载，因此一次性制备高聚合度kappa-卡拉胶寡糖单体，尤其是偶数十糖及以上单体成为本领域亟待解决的关键技术问题。
技术实现思路
为了克服上述现有技术中的不足，本专利技术提供一种新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法，实现一次性制备高聚合度卡拉胶寡糖单体，特别是制备高聚合度的卡拉胶十糖、卡拉胶十二糖、卡拉胶十四糖，填补国内技术空白。本专利技术通过下述技术方案实现上述技术效果：一种新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法，具体包括以下步骤：（1）新kappa-卡拉胶寡糖的降解制备：用0.01-1mol/L的Na2HPO4·12H2O将kappa-卡拉胶配置为浓度为0.5%-2%的溶液，35-60℃加热搅拌使之完全溶解；将制备好的kappa-卡拉胶酶与kappa-卡拉胶溶液按照1:7-10的比例混合，30-50℃水浴加热搅拌5-10min；将酶解后的液体100℃灭活10-20min；酶解的产物5000-1200r/min高速离心5-15min，真空冷冻干燥后的kappa-卡拉胶寡糖粉末；（2）新kappa-卡拉胶寡糖单体的分离纯化：将酶解制得的新kappa-卡拉胶寡糖用0.01-1mol/ml的盐溶液溶解，溶解液用孔径为0.22um的微孔滤膜过滤。以0.01-1mol/ml的盐溶液为流动相，用Bio-Gel-P6fine凝胶柱进行分离，按洗脱峰合并收集，浓缩，然后冷冻干燥即得，共得新kappa-卡拉胶二糖至十四糖7种单体寡。所述盐溶液是指硫酸钠、醋酸钠、碳酸氢铵、氯化铵溶液中的一种。（3）培养基的制备：活化培养基（g/L）:K-卡拉胶10g，琼脂10g，FeS04•7H200.02g，蛋白胨3g，NaC120g，无机盐母液100ml，H20900ml，pH7.0，，121℃高温高压灭菌20min。(无机盐浓度:MgS04.7H200.05%，CaC120.02%，KH2P040.1%)。发酵培养基（g/L）:K-卡拉胶1g，FeS04•7H200.02g，蛋白胨3g，陈海水1000mL，pH自然，，121℃高温高压灭菌20min。上述卡拉胶酶解液由实验室自主筛选菌株发酵菌株发酵制得。制备方法如下：将筛选的Cellulophagalyticastrain:N5-2菌种先接种于活化培养基中，于20-30℃、150-250rpm/min摇床培养15-20h，进行培养活化；按2-4%的接种量将种子液接种到发酵培养基中，20-30℃、150-250rpm/min摇床培养15-20h；将发酵液在4℃条件下，4000-5000r/min冷冻离心20min，离心后取上清液，即为卡拉胶酶解液。优选的，一种新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法，包括以下步骤：（1）新kappa-卡拉胶寡糖的降解制备：用0.01-1mol/L的Na2HPO4·12H2O将kappa-卡拉胶配置为浓度为0.5%-2%的溶液，35-60℃加热搅拌使之完全溶解；将制备好的kappa-卡拉胶酶与kappa-卡拉胶溶液按照1:7-10的比例混合，30-50℃水浴加热搅拌5-10min；将酶解后的液体100℃灭活10-20min；酶解的产物5000-1200r/min高速离心5-15min，真空冷冻干燥后的kappa-卡拉胶寡糖粉末；（2）新kappa-卡拉胶寡糖单体的分离纯化：将酶解制得的新kappa-卡拉胶寡糖用0.01-1mol/ml的盐溶液溶解，溶解液用孔径为0.22um的微孔滤膜过滤。以0.01-1mol/ml的盐溶液为流动相，用Bio-Gel-P6fine凝胶柱进行分离，按洗脱峰合并收集，浓缩，然后冷冻干燥即得，共得新kappa-卡拉胶二糖至十四糖7种单体寡糖。所述盐溶液是指硫酸钠、醋酸钠、碳酸氢铵、氯化铵溶液中的一种。本专利技术提供一种新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：1）本专利技术可以一次性制备出高纯度的高聚合度新kappa-卡拉胶二糖至十四糖7种单体寡糖；试验结果表明一般二次纯化每一次都要损失50%以上，本专利技术可以一次性制备出高聚合度的卡拉胶寡糖单体，不需要二次纯化，提高了卡拉胶寡糖单体的收率，降低了生产成本；2）本专利技术采用酶法降解，使得制备过程简单快捷、条件温和产物得率高、质量稳定，能够一次性得到新kappa-卡拉胶二糖至十四糖。弥补现有技术上不足，特别是可以提供高聚合度kappa-卡拉胶寡糖的标准品，即新kappa-卡拉胶十糖至十四糖，为构效关系和应用开发研究提供足量的高纯度新kappa-卡拉胶寡糖单体；3）本申请操作简单，分离时间短；方法重复性好，易于推广应用。附图说明图1A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新kappa‑卡拉胶寡糖单体的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：（1）新kappa‑卡拉胶寡糖的降解制备：用0.01‑1mol/L的Na2HPO4·12H2O将kappa‑卡拉胶配置为浓度为0.5%‑2%的溶液，35‑60℃加热搅拌使之完全溶解；将制备好的kappa‑卡拉胶酶与kappa‑卡拉胶溶液按照1:7‑10的比例混合，30‑50℃水浴加热搅拌5‑10min；将酶解后的液体100℃灭活10‑20min；酶解的产物5000‑1200r/min高速离心5‑15min，真空冷冻干燥后的kappa‑卡拉胶寡糖粉末；（2）新kappa‑卡拉胶寡糖单体的分离纯化：将酶解制得的新kappa‑卡拉胶寡糖用0.01‑1mol/ml的盐溶液溶解，溶解液用孔径为0.22um的微孔滤膜过滤；以0.01‑1mol/ml的盐溶液为流动相，用Bio‑Gel‑P6fine凝胶柱进行分离，按洗脱峰合并收集，浓缩，然后冷冻干燥即得，共得新kappa‑卡拉胶二糖至十四糖7种单体寡糖。

【技术特征摘要】
1.一种新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：（1）新kappa-卡拉胶寡糖的降解制备：用0.01-1mol/L的Na2HPO4·12H2O将kappa-卡拉胶配置为浓度为0.5%-2%的溶液，35-60℃加热搅拌使之完全溶解；将制备好的kappa-卡拉胶酶与kappa-卡拉胶溶液按照1:7-10的比例混合，30-50℃水浴加热搅拌5-10min；将酶解后的液体100℃灭活10-20min；酶解的产物5000-1200r/min高速离心5-15min，真空冷冻干燥后的kappa-卡拉胶寡糖粉末；（2）新kappa-卡拉胶寡糖单体的分离纯化：将酶解制得的新kappa-卡拉胶寡糖用0.01-1mol/ml的盐溶液溶解，溶解液用孔径为0.22um的微孔滤膜过滤；以0.01-1mol/ml的盐溶液为流动相，用Bio-Gel-P6fine凝胶柱进行分离，按洗脱峰合并收集，浓缩，然后冷冻干燥即得，共得新kappa-卡拉胶二糖至十四糖7种单体寡糖。2.根据权利要求1所述的新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法，其特征在于所述盐溶液是指硫酸钠、醋酸钠、碳酸氢铵、氯化铵溶液中的一种。3.根据权利要求1所述的新kappa-卡拉胶寡糖单体的制备方法，其特征在于所述卡拉胶酶解液由实验室自主筛选菌株发酵菌株发酵制得，制备方法如下：将筛选的Cellulophagalyticastrain:N5-2菌种先接种于活化培养基中，于20-30℃、150-250rpm/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：高芹芹，赵峡，张斌，管昶，王丽丽，岳帆，
申请(专利权)人：青岛博智汇力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37