聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白及其制备方法与制药应用技术

本发明专利技术公开了一种聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白，还公开了其制备方法，采用PEG修饰剂为甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯，mPEG‑SC与藻蓝蛋白反应后，经阴离子交换树脂色谱分离，即得到聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白。本发明专利技术的聚乙二醇修饰藻蓝蛋白，不仅可以获得有活性的修饰产物，而且修饰产物的活性比未修饰的进一步增强，并且修饰产物的免疫原性显著降低，药物半衰期明显延长；本发明专利技术的聚乙二醇修饰藻蓝蛋白的制备方法简单易行。

【技术实现步骤摘要】
聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白及其制备方法与制药应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白及其制备方法与制药应用。
技术介绍
藻蓝蛋白是存在于螺旋藻中的一种水溶性蓝绿色蛋白，根据吸收光谱范围的不同藻蓝蛋白可以分为三种：C-藻蓝蛋白、R-藻蓝蛋白和R-藻蓝蛋白Ⅱ，其中C-藻蓝蛋白主要存在于蓝藻中，R-藻蓝蛋白主要存在于红藻中，R-藻蓝蛋白Ⅱ主要存在于聚球藻中。藻蓝蛋白由α亚基和β亚基以及一个藻蓝素基团构成，α亚基通过cys84与藻蓝素相连，β亚基通过cys82和cys153与藻蓝素相连，两个亚基中含有丰富的保守的α-螺旋，从不同藻类中提取的藻蓝蛋白具有相似性较强的氨基酸序列和三维空间结构。对藻蓝蛋白的空间结构的研究表明，3个αβ单聚体构成一个(αβ)3三聚体，藻蓝蛋白的三聚体为一个中空的圆柱状结构，两个(αβ)3形成一个圆盘状(αβ)6六聚体，(αβ)3和(αβ)6为藻蓝蛋白的功能形式。藻蓝蛋白的纯度用A620/A280表示，A620/A280大于0.7时为食用级藻蓝蛋白，A620/A280大于3.0时为反应级藻蓝蛋白，A620/A280大于4.0时为分析级藻蓝蛋白。多项研究表明藻蓝蛋白具有重要的应用价值：藻蓝蛋白是一种天然色素，在食品、化妆品领域得到广泛应用；藻蓝蛋白具有荧光特性，可以作为荧光探针，用于免疫诊断学的研究；藻蓝蛋白还具有重要的药用价值，研究表明藻蓝蛋白具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、肝保护作用以及清除自由基等作用。近年来，随着生物技术的发展，蛋白质药物越来越多地应用于疾病的预防和治疗，据估计蛋白质药物正以10％-35％的速度逐年增加。虽然蛋白质药物疗效确切、作用位点专一，但随着临床应用的蛋白质药物的增多，人们逐渐发现了这类药物的一些缺点，如半衰期短、存在免疫原性、易被蛋白水解酶降解、肾清除率高、以及低溶解性等缺陷，这些问题限制了蛋白质药物的进一步发展。近年来，国内外都在积极探寻解决这些问题的方法，如改变蛋白质氨基酸序列，减少药物的水解；将蛋白质药物与白蛋白融合，从而延长药物半衰期；使用合适的药物传递载体等。其中PEG修饰是一种极为有效的方法，经PEG修饰后的蛋白质药物性质稳定、毒性降低、水溶性增大、聚集倾向降低、免疫原性降低、对蛋白水解酶更稳定。聚乙二醇是一种线性、在水溶液中可溶的不带电荷的聚合物，具有无毒、无免疫原性、以及良好的生物相容性等特性。PEG与活性基团连接后可作为一种修饰剂，可用PEG修饰剂来修饰蛋白质类药物，改善蛋白质类药物的性质，使其更好地发挥药效。PEG主要从以下几个方面提高药效：(1)PEG修饰后的蛋白质分子量增大，肾清除率降低、半衰期延长；(2)PEG能够掩盖蛋白质表面的抗原识别位点，降低免疫原性；(3)PEG水溶性较好，提高蛋白质药物在水溶液中的溶解度；(4)PEG在蛋白质表面起到屏蔽和位阻效应，降低蛋白酶的水解作用，提高稳定性。近年来随着PEG修饰技术在生物
的发展，越来越多的蛋白质药物采用PEG修饰技术来提高药效。但迄今为止，还未见有对藻蓝蛋白进行PEG修饰的报道。PEG修饰剂对蛋白质类药物的修饰主要是对蛋白质或多肽上的氨基或-SH进巯基行修饰。蛋白质中可以被定点修饰的氨基主要是蛋白质N端的氨基和赖氨酸的ε-氨基，通常蛋白质N端的氨基的pKa为7.6-8.0，赖氨酸的ε-氨基的pKa为10.0-10.2，因此，可以通过控制溶液pH来对蛋白质N端的α-氨基进行修饰。聚乙二醇琥珀酰亚胺基碳酸酯(mPEG-SC)是目前最常用的带活性基团的PEG衍生物,它和蛋白偶合生成的氨基甲酸酯键比酯键要稳定,现广泛用于与药物的偶联反应中。
技术实现思路
专利技术目的：针对上述现有技术，本专利技术提供了一种在保持藻蓝蛋白活性的前提下，降低其免疫原性，减轻过敏反应的聚乙二醇修饰藻蓝蛋白，并提供了其制备方法以及制药应用。技术方案：本专利技术所述的一种聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白，结构通式如下：其中：m为单甲氧基，n＝0-3，R代表去除一个氨基(NH2)的藻蓝蛋白分子。本专利技术所述聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)取藻蓝蛋白和PEG修饰剂，分别用磷酸盐缓冲液溶解；(2)将步骤(1)溶解后的藻蓝蛋白和PEG修饰剂混合反应，反应后加入甘氨酸终止反应；(3)将步骤(2)的反应混合液用阴离子交换树脂色谱层析分离，得到聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白。步骤(1)中，所述的藻蓝蛋白包括从所有藻类中提取的藻蓝蛋白。步骤(1)中，所述PEG修饰剂为甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)，分子量为5-40kD，优选20kD。步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液pH为6.0-7.5。步骤(2)中，所述藻蓝蛋白和PEG修饰剂的摩尔比为1:1-10，优选1:5。步骤(2)中，反应温度为4℃-25℃，反应时间为1-24h。步骤(3)中，阴离子交换树脂色谱层析采用的流动相为含NaCl的磷酸盐缓冲液。步骤(3)中，加入甘氨酸至终浓度1M终止反应。上述聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白在制备预防和/或治疗藻蓝蛋白所涉及的疾病的药物中的应用，所述疾病为宫颈癌、肝癌细胞和胰腺癌等。有益效果：相比较于现有技术，本专利技术通过对藻蓝蛋白进行肽链氨基端的定点氨基修饰，不仅获得有活性的修饰产物，而且修饰产物的活性比未修饰的进一步增强，并且修饰产物的免疫原性显著降低，药物半衰期明显延长，具有用药更安全、更长效的功能。制备所得聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白还可以用于制备治疗肿瘤的药物。附图说明图1为使用SDS-PAGE检测PEG修饰藻蓝蛋白的电泳图；使用15％分离胶，5％浓缩胶；其中1为PC，2为纯化后的PEG-PC，3为未纯化的PEG-PC，4为标准分子量蛋白；图2为小鼠抗血清效价；图3为PC和PEG-PC的免疫原性测定；图4为PEG-PC对Hela细胞的生长抑制作用；图5为PEG-PC对HepG2细胞的生长抑制作用；图6为PEG-PC对MCF-7细胞的生长抑制作用。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术进行详述。藻蓝蛋白为根据文献(PreventiveeffectofphycocyaninfromSpirulinaplatensisonalloxan-injuredmice.EnvironmentalToxicologyandPharmacology,2012,34:721-726)的方法分离纯化得到。宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2、胰腺癌细胞MCF-7均购自中科院上海细胞库。mPEG-SC20000购自北京凯正生物公司。实施例1反应时间和pH值对修饰产物的影响准确称取四份7.14mgmPEG-SC20000分别加入1mLpH分别为6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸盐缓冲液，使修饰剂充分溶解。将已制备的藻蓝蛋白溶液分别用pH为6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸盐缓冲液稀释成浓度为3mg/mL的蛋白溶液。向含有mPEG-SC20000的试管中加入1mL浓度为3mg/mL的藻蓝蛋白溶液，使修饰剂与藻蓝蛋白溶液充分混匀，于4℃反应，分别在反应开始后1h、2h、5h、9h、11h、24h取样，用SDS-PAGE确定PEG藻蓝蛋白的修饰率。实验结果表明，pH为6.0、6.5、7.0、7.5时反应24小时的修饰率分别为12％、23％，39本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白，其特征在于，结构通式如下：

【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白，其特征在于，结构通式如下：其中：m为单甲氧基，n＝0-3，R代表去除一个氨基的藻蓝蛋白分子。2.权利要求1所述聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取藻蓝蛋白和PEG修饰剂，分别用磷酸盐缓冲液溶解；(2)将步骤(1)溶解后的藻蓝蛋白和PEG修饰剂混合反应，反应后加入甘氨酸终止反应；(3)将步骤(2)的反应混合液用阴离子交换树脂色谱层析分离，得到聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的藻蓝蛋白包括从所有藻类中提取的藻蓝蛋白。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的PEG修饰剂为甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧瑜，高冰，马鹏，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32