一种牙类器官冻存方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及到一种牙类器官冻存方法,获取供体类牙器官；包括类牙器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置8‑12min，再将容器置于冷冻条件下保存12~36h后转移至液氮中保存；使用时将容器置于37‑40℃水浴中快速解冻复苏；取出类牙器官，用PBS缓冲液洗涤，再放入PBS缓冲液或生理盐水中浸泡待用等步骤。本发明专利技术中将发育中的器官进行冻存，冻存后能继续发育成成熟器官，且有着高的活性和发育能力；冻存方法操作简便，重复性好，并容易进行推广。

【技术实现步骤摘要】
一种牙类器官冻存方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及到一种牙类器官冻存方法。
技术介绍
体外冻存技术目前已广泛应用于细胞研究领域，但目前对于器官培养的冻存研究尚无大量文献报导。牙齿的外层由牙本质、牙釉质和牙骨质等硬组织包绕，内部则为牙髓软组织，是一个特化的器官。对于这种兼具软硬组织的器官，体外冻存是具有挑战性和难度。从发育学的角度看，器官发育是一个动态的整体，任何器官的发育都离不开周围的环境，而另一方面，器官本体周围的环境也在同时进行发育，随时产生变化，这也强调了发育的复杂性和发育学研究的难点。全牙的保存之所以困难，主要是因为牙体硬组织阻挡了冻存保护液向髓腔内渗透，牙髓的活力在冻存后通常难以保留，牙髓组织会发生不同程度的变性，坏死。牙齿外层硬质材料无法渗透营养液，也决定了牙胚不好增育。比如对大鼠切牙进行冻存，其冠部2/3牙髓几乎全部丧失活力，而根尖1/3部分的牙髓可保存较高的活性。体外冻存人类三磨牙，结果也显示根尖1/3的牙髓成纤维细胞有较强的活力，根中1/3的细胞活力下降，冠髓则未见成纤维细胞。目前关于牙再生研究主要有两种：1、基于发育学原理，通过诱导具有成牙潜能的上皮与间充质细胞，重组牙胚或牙胚类器官，使二者再相互诱导发育形成牙体组织；2、利用组织工程原理，在体外复合干细胞，生长因子与支架材料，分别构建牙体硬组织，牙周组织与牙髓组织，再组合构建组织工程牙。牙胚重组和组织工程牙的构建都存在诸多限制：重组牙胚需要具有成牙能力的上皮或者间充质细胞来诱导重组体定向发育，但胚胎期的牙胚难以获取，几乎不可能实现，而胚胎干细胞，诱导多能干细胞的研究目前还不够成熟，难以对其精确地定向诱导。对于组织工程牙，成体干细胞的选取和诱导，生物支架材料的选择和制备，都还需要通过大量实验的摸索优化，距广泛临床应用尚还有一定距离。自体牙移植相较上述两种方法来说，其在临床上已有使用，具有一定优势。预防性拔除智齿和因正畸需求拔除的牙齿均可作为供体牙来源。自体牙移植还可规避诸如免疫排斥、伦理等临床应用问题。但其适应范围相对受限，需要牙缺失患者自身同时具备合适的供体牙来源。有人为解决这个问题，尝试对牙齿在体外进行冻存，旨在拓宽其适应证，但保存后的牙齿活力难以维持,发育能力弱或失去。因此，自体牙移植和牙再植术在临床上尚不甚成熟。目前如何将冻存牙类作为一种医疗资源使用，且又能再发育，又具有高活性和发育能力，这是现在所需要的。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种牙类器官冻存方法，将发育中的器官进行冻存，冻存后能继续发育成成熟器官，且有着高的活性和发育能力；冻存方法操作简便，重复性好，并容易进行推广。牙类器官：牙发育过程中一定时期的牙胚；或利用多能干细胞或成体干细胞，模拟体内牙发育模式，通过干细胞自组装和定向分化，体外三维培养形成具有一定结构和功能的牙胚类似物。解决以上技术问题的一种类牙器官冻存方法，其特征在于：(1)获取供体牙类器官；(2)牙类器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置8-12min，再将容器置于冷冻条件下保存12～36h后转移至液氮中保存；使冻存保护液渗透进入到硬组织包裹的牙乳头中，从而使牙乳头在复苏后保留了良好的活性，继续发育成为牙髓牙本质复合体。(3)使用时将容器置于37-40℃水浴中解冻复苏；(4)取出牙类器官，用PBS缓冲液洗涤，再放入PBS缓冲液或生理盐水中浸泡待用。洗涤可洗涤2次。在已获得供体牙来源后，供体牙单位在体外的培养和保存将成为决定牙移植与牙再生适应证范围的重要因素。所述步骤(2)中培养基为含质量百比为8～12％二甲基亚砜(DMSO)的BGJb培养基；冷冻温度为-70～-80℃。DMSO为冻存保护剂。所述容器置于-80℃条件下保存24h；所述液氮浓度≥98％；所述二甲基亚砜的质量百分比浓度为10％。进一步优化方案中，所述牙胚为上颌第一磨牙牙胚或第二磨牙牙胚，优选为上颌第一磨牙牙胚。在一个牙根尚未形成，根方无硬组织遮挡的时间点，尝试将牙胚进行体外保存。此外，即便对于重组牙类器官和组织工程牙而言，为了将来更进一步地临床转化应用，体外的冻存培养也是十分具有意义的。也利用牙根尚未开始发育，根方尚无硬组织的牙胚进行冻存，并尝试将牙胚资源化。本专利技术中牙胚在历经冻存后仍然能够发育出生理牙根。牙根的功能是否能够得以保留关系着整个牙齿的命运。冻存保护液可渗透进入到硬组织包裹的牙乳头中，从而使牙乳头在复苏后保留了良好的活性，继续发育成为牙髓牙本质复合体。出生后第八天的小鼠上颌第一磨牙牙胚处于钟状末期，根方为软组织，利于培养液的液体交换。牙胚在历经冻存后仍然能够发育出生理牙根，不即作为一种资源进行收集和保存外，还为将来组织工程牙或者体外类器官的构建提供了实验基础。所述牙胚为小鼠右侧上颌第一磨牙牙胚。所述牙胚处于钟状末期，牙根尚未发育，根方敞开，根面为牙乳头软组织，且牙根的发育即将开始。出生后第八天的小鼠上颌第一磨牙处于钟状末期，牙根尚未发育，根方敞开，根面为牙乳头软组织，且牙根的发育即将开始。其形态特点适合作为移植手术的研究对象：第一，取出时不存在牙根的阻力，易于脱位；第二，其为椭圆形，能够很好地适应牙槽窝形态；第三，根面为软组织，利于培养液的液体交换，可作为体外器官培养的对象；第四，其具有牙根发育潜能，可在移植术后观察到整个牙根发育的过程。理论上，越早期的牙胚发育潜能越强，但从实验的可操作性上，较大的乳鼠更易于操作且对手术创伤的耐受力更强，存活率更高。出生后十天的小鼠上颌第二磨牙，位置较深，操作视野及空间更为受限，但仍可进行操作；体积较小，大约为第一磨牙的一半，相较于第一磨牙的类平行四边形形态，其更趋近于不规则球形，故拔除阻力小，易于脱位。所述步骤(1)中获取供体牙类器官的方式为建立动物模型，即小鼠钟状末期类牙器官的拔除模型。所述冻存方法还包括牙类器官的移植模型步骤，使符合移植要求的牙类器官存活率高。采用一些方法尝试牙再生，需要在牙槽骨中原位移植牙槽骨进行验证。在此之前，评估上皮-间充质重组体的发育状况、组织工程牙的再生能力或自体牙的活力保存情况重点步骤，确认移植牙的牙根能够继续生长发育并与牙槽骨形成稳固的牙周附着关系，以确保其可能行使功能。本专利技术中小鼠钟状末期上颌第一磨牙牙胚的拔除与移植模型对这些进行了合适的评估。采用正在发育的颌骨作为载体，将牙胚置于其中进行观察研究，其发育过程必将最接近于生理条件下的牙齿发育过程，可以为以后实现临床功能性牙再生提供条件。本专利技术中小鼠钟状末期上颌第一磨牙牙胚的拔除与移植模型，重复性好，稳定可靠，包括步骤如下：(1)获取牙胚、小鼠上颌离体第一磨牙并观察：牙胚浸泡于等渗PBS缓冲液中，即刻体视显微镜观察；上颌第一磨牙用4％多聚甲醛固定过夜，10％EDTA溶液脱矿8天，包埋切片，H&E染色观察。小鼠为出生后第八天及第十天小鼠。(2)出生后第八天小鼠上颌第一磨牙的拔除：麻醉与固定，术野的暴露及口内术区观察，切口，翻瓣，骨切开，取出牙胚；(3)出生后第八天小鼠上颌第一磨牙的原位移植：供体牙胚的获取及牙胚的移植；剥除牙槽骨上的粘骨膜后，自牙槽嵴顶无骨质区分别向颊腭侧剥离骨质，暴露牙冠，将牙胚向颊侧轻推脱位，由底部轻轻端起牙胚，浸泡于无菌PBS缓冲液中备用；取供体牙胚轻放在拔牙窝远本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牙类器官冻存方法，其特征在于：（1）获取供体牙类器官；（2）牙类器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置8‑12min，再将容器置于冷冻条件下保存12~36h后转移至液氮中保存；（3）使用时将容器置于37‑40℃水浴中解冻复苏；（4）取出牙类器官，用PBS缓冲液洗涤，再放入PBS缓冲液或生理盐水中浸泡待用。

【技术特征摘要】
1.一种牙类器官冻存方法，其特征在于：（1）获取供体牙类器官；（2）牙类器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置8-12min，再将容器置于冷冻条件下保存12~36h后转移至液氮中保存；（3）使用时将容器置于37-40℃水浴中解冻复苏；（4）取出牙类器官，用PBS缓冲液洗涤，再放入PBS缓冲液或生理盐水中浸泡待用。2.根据权利要求1所述的一种牙类器官冻存方法，其特征在于：所述步骤（2）中培养基为含质量百分比为8~12%二甲基亚砜的BGJb培养基；冷冻温度为-70~-80℃。3.根据权利要求1或2所述的一种牙类器官冻存方法，其特征在于：所述容器置于-80℃条件下保存24h；所述液氮浓度≥98%；所述二甲基亚砜的质量百分比浓度为10%。4.根据权利要求1所述的一种牙类器官冻存方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：田卫东，李星瀚，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51