一种罗非鱼湖病毒强毒株及其RPA检测引物和方法技术

本发明专利技术公开了一种罗非鱼湖病毒强毒株及其RPA检测引物和方法，本发明专利技术设计了针对RPA反应的引物组；本发明专利技术首次分离出罗湖病毒，而且检测方法快速简便、特异性强，灵敏度高，适用于养殖场的现场检测等，具有极高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种罗非鱼湖病毒强毒株及其RPA检测引物和方法
本专利技术属于病毒分子检验领域，关于一种罗非鱼湖病毒强毒株以及其RPA(聚合酶扩增技术)检测引物和方法。
技术介绍
自2009年开始，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国、印度、马来西亚、中华台北等区域相继暴发了一种新型RNA病毒---罗非鱼湖病毒，简称罗湖病毒(TilapiaLakeVirus，TiLV)，给全世界的罗非鱼养殖带来巨大威胁和严峻挑战。罗非鱼湖病毒初步确定与流感病毒同为正粘病毒科，也是一种高度传染性的烈性病毒，感染罗非鱼湖病毒可导致罗非鱼死亡率高达70％--90％，罗非鱼湖病毒所引发的疫病引起了全球罗非鱼养殖业及相关产业的高度重视。由于TiLV具有高传染性和高死亡率等特点，引起了全球罗非鱼养殖产业的高度恐慌和重视，该疫病一旦全面爆发和流行，必将给罗非鱼养殖业造成毁灭性打击，不仅影响养殖其产量，更严重影响其出口贸易，从而加剧各国之间的经济矛盾和冲突。由于罗非鱼湖病毒病的发生和流行具有较强的温度依赖性，冬季时，该区域的水温一直低于25℃，加上控制措施采取得当，所以疫情没有进一步加大和扩散。我国的广东、海南、广西、江苏等多个区域均出现罗湖病毒，可见该病毒在我国具有普遍存在和分布的现象，根据这个疫病在国外的流行规律和情况来判断，罗非鱼湖病毒病后续在我国将会有继续扩散和流行的趋势。目前对于该新发疫病的流行病学和病原学都了解甚少，更缺乏有效的防治办法和控制措施，一旦疫情大规模爆发，将会给我国的罗非鱼养殖产业带来毁灭性的打击。由于TiLV基因组存在显著的地理差异，因而针对不同的地理株应用分子生物学方法，可能存在特异性和敏感性的不同，甚至出现假阴性的结果，将严重影响罗湖病毒病的现场诊断、病原监测、流行病学调查及疫情处理。然而，到目前为止，还没有开发出有效的药物或疫苗来预防由TiLV引起的疾病。因此，筛选出适用性强的特异性引物和建立一种快速可靠的检测TiLV方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种罗非鱼湖病毒GD1710株。本专利技术的另一目的在于提供了罗非鱼湖病毒PRA检测引物。本专利技术所采取的技术方案是：一种快速检测罗非鱼湖病毒的RPA引物，其核苷酸如下所示：TiLV-S2-F：5'-GGCGGCTCTAGGGTACA-3'；TiLV-S2-R：5'-CGAAGTGTTGGAACCCGTCAT-3'。一种快速检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。进一步的，该试剂盒中还包括酶、醋酸镁和再水化缓冲液RehydrationBuffer。一种快速检测罗非鱼湖病毒的RPA方法，包含以下步骤：1)提取样本核酸；2)以提取的核酸为模板，用上述所述的引物TiLV-S2-F和TiLV-S2-R和醋酸镁，进行RPA反应；3)将RPA反应产物进行PCR反应，确定样品中是否含有罗非鱼湖病毒。进一步的，步骤2)中的RPA反应体系为：RehydrationBuffer29.5μL；TiLV-S2-F2μL；TiLV-S2-R2μL；核酸模板1μL；醋酸镁2.5μL；RPA扩增酶1000IU；ddH2O补至50μL。进一步的，RPA反应条件为：在39～41℃下反应。进一步的，RPA反应条件为：反应时间为20～30min。一株罗非鱼湖病毒株TiLV-GD1710，于2017年7月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：V201807，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的有益效果是：(1)首次自患病的罗非鱼中分离出罗湖病毒，对于我国罗湖病毒病及其防控技术的研究具备开拓性的意义。(2)本专利技术的方法快速简便：本专利技术所建的RPA方法1小时内完成检测，快速准确地分析检测，相比较传统病毒分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。(3)本专利技术的方法特异性强：这对特异性引物对保守区域的靶序列的特异性识别，保证了RPA方法扩增的高度特异性；(4)灵敏度高，可以检测浓度为5.8×101copies/μL的核酸。附图说明图1为本专利技术提供的采用罗非鱼脑细胞分离罗湖病毒GD1710结果示意图；第2d开始产生细胞病变效应(CPE)(A1)，第4d和第6d病变脱离的细胞分别达到50％(A2)和70％以上(A3)，而对照组则没有明显变化(B1-B3)。图2为分离的TiLV-GD1710感染细胞后通过透射电镜进行形态学鉴定结果，病毒粒子呈圆形，且表面有突起的丝状结构，完整病毒粒子的直径在100nm-120nm之间。图3为RPA反应扩增产物结果分析示意图，其中泳道M为marker，泳道P为阳性对照,泳道N为阳性对照。图4为罗湖病毒RPA检测引物特异性试验结果，其中泳道M为marker，泳道1-8分别为TiLV-GD1710cDNA浓度分别为，罗非鱼基因组，罗非鱼链球菌，GCRV，SVCV，KHV和阴性对照。图5为罗湖病毒RPA检测引物灵敏性试验结果，其中泳道M为marker，泳道1-8分别为5.8×107copies/μL，5.8×106copies/μL，5.8×105copies/μL，5.8×104copies/μL，5.8×103copies/μL，5.8×102copies/μL，5.8×101copies/μL和5.8×100copies/μL，泳道9为阴性对照。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1一种罗非鱼湖病毒GD1710的分离及全基因组序列测定，其主要过程如下：(1)在无菌条件下，取感染了罗非鱼湖病毒的罗非鱼的肝、肾、脾,加入含双抗的灭菌的PBS中制成1:1的匀浆液，在-20℃冻融三次后，组织匀浆液依次经2000rpm/min离心10min取上清，再经5000rpm/min离心10min取上清，最后经10000rpm/min离心取上清液经滤膜孔径为0.22μm的微孔滤器过滤除菌，接种密度为80％-90％的单层罗非鱼脑细胞(TiB细胞)。室温下吸附1h，吸弃病毒液，加入与培养液等量的维持液(含3％FBS的M199)，28℃恒温培养，每日观察病毒细胞培养物的形态。病毒传代时，将病毒细胞培养物反复冻融2-3次，再按上述接种方法做传代培养。传至第3代时，发现第2d开始产生细胞病变效应(CPE)(见图1的A1)；可见TiB细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，第4d和第6d病变脱离的细胞分别达到50％和70％以上(见图1的A2、A3)。(2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。电镜观察发现细胞内有大量圆形的病毒粒子，且病毒粒子表面有突起的丝状结构，完整病毒粒子的直径在100nm-120nm之间，与典型的正粘病毒形态相符(见图2)。新分离的病毒暂命名为TiLV-GD1710，保藏编号：CCTCCNO：V201806，地址：中国武汉武汉大学。(3)收集TiLV-GD1710病毒，对其进行全基因组测序，序列如SEQIDNO.2(Segment1-Segment10)所示。TiLV-GD1710基因组与其它已知的TiLV分离株的核苷酸序列同源性为95％～98％，氨基酸序列同源性为91％～100％；其中S2节段最为保守，其氨基酸序列同源性均在99％以上，而S9变异最大，其氨基酸序列同源性在91％至94％不等。本专利技术TiLV-GD17本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株罗非鱼湖病毒株TiLV‑GD1710，于2017年7月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：V201807。

【技术特征摘要】
1.一株罗非鱼湖病毒株TiLV-GD1710，于2017年7月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：V201807。2.一种快速检测罗非鱼湖病毒的RPA引物，其核苷酸如下所示：TiLV-S2-F：5'-GGCGGCTCTAGGGTACA-3'；TiLV-S2-R：5'-CGAAGTGTTGGAACCCGTCAT-3'。3.一种快速检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求2所述的引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括RPA扩增酶、醋酸镁和再水化缓冲液RehydrationBuffer。5.一种快速检测罗非鱼湖病毒的RPA方法，其特征在于，包含以下步骤：1)提取样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾伟伟，王英英，王庆，尹纪元，李莹莹，任燕，刘春，张德峰，石存斌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44