一种检测7型人腺病毒的RPA方法、其专用引物和探针及用途技术

本发明专利技术一种检测7型人腺病毒的RPA方法、其专用引物和探针及用途提供了用于检测7型人腺病毒的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在7型人腺病毒检测中的用途。所述检测方法、专用引物和探针是基于7型人腺病毒hexon基因保守序列设计的，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明专利技术将新型恒温扩增技术RPA应用于7型人腺病毒的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，在37℃恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物通过侧向层析试纸条实现可视化判别。本发明专利技术建立的检测方法灵敏度高，检测限可达10

A RPA Method for Detecting Human Adenovirus Type 7, Its Primers, Probes and Applications

The RPA method for detecting human adenovirus type 7, its special primers and probes and their uses provide a RPA detection method for detecting human adenovirus type 7, its special primers and probes and their applications in detecting human adenovirus type 7. The detection method, primers and probes are designed based on the conservative sequence of hexon gene of human adenovirus type 7. They have oligonucleotide sequences shown in SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4. The new constant temperature amplification technology RPA is applied to the detection of human adenovirus type 7. The method simulates the enzymatic reaction process of DNA replication in vivo. The DNA template is amplified by a specific combination of enzymes and proteins (recombinase, single-stranded binding protein and DNA polymerase), and the specific nucleic acid sequence is amplified at 37 (?) C. The amplified product is visualized by a lateral chromatography strip. Distinguish. The detection method established by the invention has high sensitivity and detection limit up to 10.

【技术实现步骤摘要】
一种检测7型人腺病毒的RPA方法、其专用引物和探针及用途
本专利技术一种检测7型人腺病毒的RPA方法、其专用引物和探针及用途属于生物
，涉及7型人腺病毒的分子生物学，涉及一种检测7型人腺病毒的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA）技术快速检测7型人腺病毒的方法、其专用引物和探针及其用途。
技术介绍
近几年来，全球范围内由人腺病毒(humanadenovirus，HAdV)引起呼吸道感染的公共卫生事件时有新发和暴发。尤其在亚洲地区人腺病毒7型(HAdV-7)疫情的突发和频发引起的更长住院时间和更严重呼吸道感染，给社区、学校和军营等地的生活和工作带来了很大的干扰。HADV-7为腺病毒科(Adenoviridae)的哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)B群成员之一，HADV是一种无包膜呈20面体对称的线性双链DNA病毒，病毒颗粒直径65～80nm，由蛋白衣壳、核心蛋白和DNA组成。衣壳含有240个六邻体、12个五邻体及12根纤突，六邻体含血清型特异的抗原决定簇，五邻体和纤突球部可与细胞表面的病毒受体结合，纤突球部有HADV组别和型别的抗原表位，纤突的长度和弯曲度则与血清型有关。2011年国际病毒分类委员会ADV小组规定：血清学是用于识别新型HADV的唯一依据；但也指出了编码六邻体和纤突蛋白的核酸序列可用于HADV血清型间基因差异分析和分型。近年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，RPA技术被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25-43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。
技术实现思路
本专利技术一种检测7型人腺病毒的RPA方法、其专用引物和探针及用途，所要解决的技术问题是提供了一组用于快速检测7型人腺病毒的特异性引物和探针，以及一种快速、简便、特异性好的7型人腺病毒的检测方法。因此本专利技术检测7型人腺病毒的RPA方法，第一个目的是提供用于检测7型人腺病毒的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据7型人腺病毒六邻体蛋白（hexon）基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了7型人腺病毒hexon基因的保守区，此区域为7型人腺病毒基因组（GenBank：AC_000018.1）位于第18666至21470核苷酸位点的一段序列，含有2805个碱基的核苷酸片段，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。从SEQIDNO.1序列内筛选设计特异性引物。筛选的特异性引物包括正向引物F1和反向引物R2，分别位于基因组第18832至18861核苷酸位点和第19374至19413核苷酸位点，分别具有如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的寡核苷酸序列，引物的长度为30bp左右，其中反向引物5’端标记生物素（Biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链DNA将标记有生物素。SEQIDNO.1：ATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTCGCCCGTGCAACAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAGTTTAGAAACCCCACAGTGGCGCCCACCCACGATGTGACCACCGACCGTAGCCAGCGACTGATGCTGCGCTTCGTGCCCGTTGACCGGGAGGACAATACATACTCTTACAAAGTGCGGTACACCCTCGCCGTGGGCGACAACAGAGTGCTTGACATGGCCAGCACATTCTTTGACATTAGGGGGGTGCTTGATAGAGGTCCTAGCTTCAAGCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTGGCTCCTAAGGGCGCGCCTAACACATCTCAGTGGATAGTTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCACATACACATTTGGCATTGCTTCCACGAAGGGAGACAATATTACTAAGGAAGGTTTAGAAATTGGGAAAGACATTACTGCAGACAACAAGCCCATTTATGCCGATAAAACATATCAGCCAGAGCCTCAAGTTGGAGAAGAATCATGGACTGATATTGATGGAACAAATGAAAAATTTGGAGGTAGAGCTCTTAAACCAGCTACTAAAATGAAGCCATGCTACGGGTCTTTTGCAAGACCTACAAACATAAAAGGGGGCCAAGCTAAAAACAGAAAAGTAACACCAACCGAAGGAGATGTTGAAGCTGAGGAGCCAGATATTGATATGGAATTTTTCGATGGTAGAGAAGCTGCTGACGCTTTTTCGCCTGAAATTGTGCTTTACACGGAAAATGTCAATTTGGAAACTCCAGACAGCCATGTGGTATACAAGCCAGGAACTTCTGATGGTAACTCTCATGCAAATTTGGGTCAACAAGCCATGCCTAACAGACCCAATTACATTGGCTTCAGGGATAACTTTGTAGGTCTTATGTACTACAACAGTACTGGAAATATGGGAGTTTTGGCCGGCCAAGCATCACAACTGAATGCAGTGGTTGACTTGCAGGACAGAAACACTGAACTGTCATATCAGCTTTTGCTTGATTCTCTGGGAGACAGAAGCAGATACTTCAGCATGTGGAATCAGGCTGTGGACAGCTATGATCCCGATGTTCGTATTATTGAAAATCATGGCGTCGAGGATGAACTGCCTAATTACTGTTTTCCTCTGGATGGCATAGGACCAGGGAACAAATATCAAGGCATTAAACCTAGAGACACTGCATGGGAAAAAGATACTAAAGTTTCTACAGCTAATGAAATAGCCATAGGCAACAATCTGGCTATGGAAATTAATATCCAAGCTAATCTTTGGAGAAGTTTTCTGTACTCCAATGTGGCTTTGTACCTTCCAGATGTTTACAAGTACACGCCAACTAACATTACTCTGCCCGCTAACACCAACACCTATGAGTACATGAACGGGCGAGTGGTTTCCCCATCTCTGGTCGATTCATACATCAACATTGGCGCCAGGTGGTCTCTTGACCCAATGGACAATGTGAATCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTACGCTACCGGTCCATGCTTCTGGGCAATGGCCGTTATGTGCCTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种用于检测7型人腺病毒的RPA专用引物，是根据7型人腺病毒hexon基因保守序列设计的，所述7型人腺病毒hexon基因保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列SEQ ID NO.1：ATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTCGCCCGTGCAACAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAGTTTAGAAACCCCACAGTGGCGCCCACCCACGATGTGACCACCGACCGTAGCCAGCGACTGATGCTGCGCTTCGTGCCCGTTGACCGGGAGGACAATACATACTCTTACAAAGTGCGGTACACCCTCGCCGTGGGCGACAACAGAGTGCTTGACATGGCCAGCACATTCTTTGACATTAGGGGGGTGCTTGATAGAGGTCCTAGCTTCAAGCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTGGCTCCTAAGGGCGCGCCTAACACATCTCAGTGGATAGTTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCACATACACATTTGGCATTGCTTCCACGAAGGGAGACAATATTACTAAGGAAGGTTTAGAAATTGGGAAAGACATTACTGCAGACAACAAGCCCATTTATGCCGATAAAACATATCAGCCAGAGCCTCAAGTTGGAGAAGAATCATGGACTGATATTGATGGAACAAATGAAAAATTTGGAGGTAGAGCTCTTAAACCAGCTACTAAAATGAAGCCATGCTACGGGTCTTTTGCAAGACCTACAAACATAAAAGGGGGCCAAGCTAAAAACAGAAAAGTAACACCAACCGAAGGAGATGTTGAAGCTGAGGAGCCAGATATTGATATGGAATTTTTCGATGGTAGAGAAGCTGCTGACGCTTTTTCGCCTGAAATTGTGCTTTACACGGAAAATGTCAATTTGGAAACTCCAGACAGCCATGTGGTATACAAGCCAGGAACTTCTGATGGTAACTCTCATGCAAATTTGGGTCAACAAGCCATGCCTAACAGACCCAATTACATTGGCTTCAGGGATAACTTTGTAGGTCTTATGTACTACAACAGTACTGGAAATATGGGAGTTTTGGCCGGCCAAGCATCACAACTGAATGCAGTGGTTGACTTGCAGGACAGAAACACTGAACTGTCATATCAGCTTTTGCTTGATTCTCTGGGAGACAGAAGCAGATACTTCAGCATGTGGAATCAGGCTGTGGACAGCTATGATCCCGATGTTCGTATTATTGAAAATCATGGCGTCGAGGATGAACTGCCTAATTACTGTTTTCCTCTGGATGGCATAGGACCAGGGAACAAATATCAAGGCATTAAACCTAGAGACACTGCATGGGAAAAAGATACTAAAGTTTCTACAGCTAATGAAATAGCCATAGGCAACAATCTGGCTATGGAAATTAATATCCAAGCTAATCTTTGGAGAAGTTTTCTGTACTCCAATGTGGCTTTGTACCTTCCAGATGTTTACAAGTACACGCCAACTAACATTACTCTGCCCGCTAACACCAACACCTATGAGTACATGAACGGGCGAGTGGTTTCCCCATCTCTGGTCGATTCATACATCAACATTGGCGCCAGGTGGTCTCTTGACCCAATGGACAATGTGAATCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTACGCTACCGGTCCATGCTTCTGGGCAATGGCCGTTATGTGCCTTTCCACATACAAGTGCCTCAAAAATTCTTTGCTGTCAAGAACCTACTTCTTCTACCTGGCTCCTACACCTATGAGTGGAACTTCAGAAAGGATGTGAACATGGTCCTGCAAAGTTCCCTTGGAAATGACCTCAGAACAGATGGTGCTAACATAAGTTTCACCAGCATCAACCTCTATGCCACCTTCTTCCCCATGGCTCACAACACCGCTTCAACTCTTGAAGCCATGCTGCGCAACGATACCAATGATCAGTCATTCAACGACTACCTCTCTGCAGCTAACA...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测7型人腺病毒的RPA专用引物，是根据7型人腺病毒hexon基因保守序列设计的，所述7型人腺病毒hexon基因保守序列具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列SEQIDNO.1：ATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTCGCCCGTGCAACAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAGTTTAGAAACCCCACAGTGGCGCCCACCCACGATGTGACCACCGACCGTAGCCAGCGACTGATGCTGCGCTTCGTGCCCGTTGACCGGGAGGACAATACATACTCTTACAAAGTGCGGTACACCCTCGCCGTGGGCGACAACAGAGTGCTTGACATGGCCAGCACATTCTTTGACATTAGGGGGGTGCTTGATAGAGGTCCTAGCTTCAAGCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTGGCTCCTAAGGGCGCGCCTAACACATCTCAGTGGATAGTTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCACATACACATTTGGCATTGCTTCCACGAAGGGAGACAATATTACTAAGGAAGGTTTAGAAATTGGGAAAGACATTACTGCAGACAACAAGCCCATTTATGCCGATAAAACATATCAGCCAGAGCCTCAAGTTGGAGAAGAATCATGGACTGATATTGATGGAACAAATGAAAAATTTGGAGGTAGAGCTCTTAAACCAGCTACTAAAATGAAGCCATGCTACGGGTCTTTTGCAAGACCTACAAACATAAAAGGGGGCCAAGCTAAAAACAGAAAAGTAACACCAACCGAAGGAGATGTTGAAGCTGAGGAGCCAGATATTGATATGGAATTTTTCGATGGTAGAGAAGCTGCTGACGCTTTTTCGCCTGAAATTGTGCTTTACACGGAAAATGTCAATTTGGAAACTCCAGACAGCCATGTGGTATACAAGCCAGGAACTTCTGATGGTAACTCTCATGCAAATTTGGGTCAACAAGCCATGCCTAACAGACCCAATTACATTGGCTTCAGGGATAACTTTGTAGGTCTTATGTACTACAACAGTACTGGAAATATGGGAGTTTTGGCCGGCCAAGCATCACAACTGAATGCAGTGGTTGACTTGCAGGACAGAAACACTGAACTGTCATATCAGCTTTTGCTTGATTCTCTGGGAGACAGAAGCAGATACTTCAGCATGTGGAATCAGGCTGTGGACAGCTATGATCCCGATGTTCGTATTATTGAAAATCATGGCGTCGAGGATGAACTGCCTAATTACTGTTTTCCTCTGGATGGCATAGGACCAGGGAACAAATATCAAGGCATTAAACCTAGAGACACTGCATGGGAAAAAGATACTAAAGTTTCTACAGCTAATGAAATAGCCATAGGCAACAATCTGGCTATGGAAATTAATATCCAAGCTAATCTTTGGAGAAGTTTTCTGTACTCCAATGTGGCTTTGTACCTTCCAGATGTTTACAAGTACACGCCAACTAACATTACTCTGCCCGCTAACACCAACACCTATGAGTACATGAACGGGCGAGTGGTTTCCCCATCTCTGGTCGATTCATACATCAACATTGGCGCCAGGTGGTCTCTTGACCCAATGGACAATGTGAATCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTACGCTACCGGTCCATGCTTCTGGGCAATGGCCGTTATGTGCCTTTCCACATACAAGTGCCTCAAAAATTCTTTGCTGTCAAGAACCTACTTCTTCTACCTGGCTCCTACACCTATGAGTGGAACTTCAGAAAGGATGTGAACATGGTCCTGCAAAGTTCCCTTGGAAATGACCTCAGAACAGATGGTGCTAACATAAGTTTCACCAGCATCAACCTCTATGCCACCTTCTTCCCCATGGCTCACAACACCGCTTCAACTCTTGAAGCCATGCTGCGCAACGATACCAATGATCAGTCATTCAACGACTACCTCTCTGCAGCTAACATGCTTTACCCCATCCCTGCCAATGCAACCAACATTCCAATTTCCATCCCATCTCGCAACTGGGCAGCCTTCAGGGGCTGGTCCTTCACCAGACTCAAAACCAAGGAGACTCCATCTCTTGGATCAGGGTTCGATCCCTACTTCGTTTATTCTGGATCTATTCCCTACCTGGATGGCACTTTTTACCTTAACCACACTTTCAAGAAGGTCTCCATCATGTTTGACTCCTCAGTCAGCTGGCCTGGCAATGACAGGCTGTTGTCTCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李越希，齐永，李晓玲，李佳萌，饶继先，沈万鹏，刘苏云，曾雯雯，郑书龙，郦钰超，
申请(专利权)人：李越希，
类型：发明
国别省市：江苏,32