白蛋白启动子驱动的白蛋白表达载体制造技术

本发明专利技术公开了由人血白蛋白启动子驱动的用于在细胞中表达白蛋白基因的载体，并在细胞中成功高效表达外源白蛋白。该表达载体由骨架和装载于骨架上的表达框组成，该表达框由人血清白蛋白启动子及其第一个内含子、白蛋白基因、内核糖体进入位点序列(IRES)和标记基因组成。该载体中人血白蛋白启动子和IRES序列驱动白蛋白基因和标记基因同时表达。利用该载体在人细胞中成功高效表达重组人血清白蛋白，分泌到培养液中的白蛋白达到750mg/L，纯度超过90％。该载体为首例用人血白蛋白启动子驱动人血白蛋白基因表达的载体，也是首例用于人细胞或哺乳动物细胞表达白蛋白的载体。该载体还克服了目的基因与筛选标记分用不同启动子的载体系统中在筛选时的高假阳性率和表达不均衡的问题。

Albumin promoter-driven albumin expression vector

The invention discloses a vector driven by human albumin promoter for expressing albumin gene in cells, and successfully and efficiently expresses exogenous albumin in cells. The expression vector is composed of a skeleton and an expression frame loaded on the skeleton. The expression frame is composed of human serum albumin promoter and its first intron, albumin gene, endoribosome entry site sequence (IRES) and marker gene. The human albumin promoter and IRES sequence in the vector drive the simultaneous expression of albumin gene and marker gene. The recombinant human serum albumin was successfully and efficiently expressed in human cells. The purity of the recombinant human serum albumin secreted into the culture medium reached 750 mg/L, exceeding 90%. The vector is the first vector to drive human albumin gene expression with human albumin promoter, and also the first vector to express albumin in human or mammalian cells. The vector also overcomes the problem of high false positive rate and uneven expression in the vector system with different promoters for target genes and screening markers.

【技术实现步骤摘要】
白蛋白启动子驱动的白蛋白表达载体
本专利技术属于基因工程
，公开了白蛋白启动子驱动的表达载体，具体的，公开了用于人细胞中高效表达重组人血清白蛋白的人血清白蛋白启动子驱动的表达载体，更具体地，公开了人血清白蛋白启动子驱动外源人血清白蛋白基因和筛选标记同时表达的双顺反子载体及其在人细胞中高效表达重组人血清白蛋白的应用。技术背景人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin，HSA)是人体血液中的主要的、含量最丰富的可溶性蛋白，其含量大约占血清总蛋白的一半[1]。人血清白蛋白主要的生理功能包括：1，增加血容量和维持血浆胶体渗透压；调节组织与血管之间水分的动态平衡；2，运输及解毒功能：白蛋白能结合阴离子也能结合阳离子，可以输送不同的物质，包括脂肪酸、胆固醇、甲状腺激素等，也可以将有毒物质输送到解毒器官；3，营养供给：组织蛋白和血浆蛋白可互相转化，在氮代谢障碍时，白蛋白可作为氮源为组织提供营养。人血清白蛋白在医学临床中的使用已经有70多年了。主要可以用于：1，失血创伤、烧伤引起的休克；2，脑水肿及损伤引起的颅压升高；3，肝硬化及肾病引起的水肿或腹水；4，低蛋白血症的防治；5，新生儿高胆红素血症；6，用于心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗和成人呼吸窘迫综合征等。药用HSA来源于人血血液提取[2]。但是在我国，由于采浆量的限制，导致HSA供不应求，价格将持续攀升。采用血源制备HSA还存在着血源可能存在潜在的疾病或病毒污染、批次间差异大等问题。因此通过基因工程的方法生产HSA的策略成为产业内的关注焦点和趋势。通过DNA重组技术，从酵母和水稻中生产HSA已经取得了巨大的成功[3]，部分产品已经获得政府药监部门的临床实验批准[4]。但是上述重组HSA用于替代血源白蛋白用作临床药物仍面临巨大挑战。由于人血清白蛋白系人体内的重要功能分子，理论上，从人细胞产生的重组人血清白蛋白将是最好的、最可能成功取代血源白蛋白用于临床的。但是目前尚无用于人细胞中表达的高效表达载体。人血清白蛋白主要由肝脏产生，肾脏也有一些表达[1,2]。人血白蛋白基因在发育的过程中呈现出逐渐升高，成年后在肝脏中呈现非常稳定地表达的特点。在特定生理和病理的条件下，白蛋白表达能够对细胞所处的营养、压力等环境变化产生一定的响应而发生改变。在白蛋白基因上游的调控区域存在启动子和多个正向和负向顺式调控元件，这些元件和细胞内多种不同的信号传导分子等反式作用因子相互作用，从而调节白蛋白的表达[5,6]。在小鼠中，白蛋白基因上游包括启动子、增强子、远端增强子等顺式元件已经被详细的鉴定出。这些元件包括接近第一个内含子的启动子和增强子元件，在转录起始位点上游1.7kb处有一个增强子，在上游6-7kb的地方还有一个远端增强子。在基因上游到更远端，则存在一些负向调控的元件[7,8]。由白蛋白基因启动子及其临近的含有TATA盒、肝核因子(hepaticnuclearfactor1，HNF1)和核因子Y(nuclearfactorY，NF-Y)结合位点，组成了启动白蛋白基因表达的核心区域，这一区域主要以激活白蛋基因的表达为主[7]。由于白蛋白基因在肝细胞中稳定、持久和高水平的表达。因此该包含白蛋白启动子的区域可能是外源基因在人细胞中稳定高效持久表达时的理想启动子[7,9]。本专利技术中，申请人构建了白蛋白启动子驱动的表达载体用于在哺乳动物细胞，特别是人细胞中高水平表达人血清白蛋白。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种白蛋白启动子驱动的表达载体，利用该载体表达人血清白蛋白。本专利技术的又一个目的是提供一种表达细胞，该细胞能表达人血清白蛋白。本专利技术的又一个目的是提供一种生产人血清白蛋白的方法。本专利技术的再一个目的是提供人血清白蛋白启动子的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：在一个方面，本专利技术提供了一种白蛋白启动子驱动的表达载体，其特征在于：所述表达载体包含表达框，所述表达框依次包括白蛋白启动子及其第一个内含子、白蛋白基因、内核糖体进入位点序列IRES、第二基因。如本文中所使用的，以下术语及短语应具有下文所述的含义。除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语均具有与本领域技术人员通常所了解相同的含义。除非本文另外明确指示，否则单数形式“一”(种/个)及“该”或“所述包括复数个指示物。术语“包含”以包涵性开放意义使用，此意谓可包括其它要素、元件。本专利技术中，“表达框”意指启动子元件与有效连接的其他转录和翻译调节控制元件的组合。可以将异源基因序列插入到表达框中以用于表达所述基因序列的目的。表达框能够指导转录，该转录导致产生关于所需基因产物的mRNA。将表达框插入到载体中以产生表达载体，这样的表达载体指导异源蛋白质在宿主细胞中的表达。“启动子”由两个基本部分(核心启动子和近端启动子)组成。启动子位于给定基因编码序列的上游。核心启动子被定义为能够指导给定基因的精确转录起始的最小核苷酸序列。真核生物中的核心启动子负责指导通过RNA聚合酶II复合物的起始。一般将核心启动子描绘为跨越转录起始位点(INR)的序列，更具体而言INR上游和下游5至45个核苷酸的序列(总长度70-90个核苷酸)。在本专利技术中，采用的是“白蛋白启动子”，优选地是人血清白蛋白启动子。人血清白蛋白主要由肝脏产生，肾脏也有一些表达[1,2]。人血白蛋白基因在发育的过程中呈现出逐渐升高，成年后在肝脏中呈现非常稳定地表达的特点。在特定生理和病理的条件下，白蛋白表达能够对细胞所处的营养、压力等环境变化产生一定的响应而发生改变。在白蛋白基因上游的调控区域存在启动子和多个正向和负向顺式调控元件，这些元件和细胞内多种不同的信号传导分子等反式作用因子相互作用，从而调节白蛋白的表达[5,6]。在小鼠中，白蛋白基因上游包括启动子、增强子、远端增强子等顺式元件已经被详细的鉴定出。这些元件包括接近第一个内含子的启动子和增强子元件，在转录起始位点上游1.7kb处有一个增强子，在上游6-7kb的地方还有一个远端增强子。在基因上游到更远端，则存在一些负向调控的元件[7,8]。由白蛋白基因启动子及其临近的含有TATA盒、肝核因子(hepaticnuclearfactor1，HNF1)和核因子Y(nuclearfactorY，NF-Y)结合位点，组成了启动白蛋白基因表达的核心区域，这一区域主要以激活白蛋基因的表达为主[7]。由于白蛋白基因在肝细胞中稳定、持久和高水平的表达。因此该包含白蛋白启动子的区域可能是外源基因在人细胞中稳定高效持久表达时的理想启动子[7,9]。此外，除人血清白蛋白启动子之外的其他血清白蛋白启动子也可以用于本专利技术的构思，并没有超出本专利技术的保护范围。在本专利技术中，人血清白蛋白启动子及其第一个内含子具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，及其变体。该变体与SEQIDNO:1具有至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的核苷酸序列。所述的差异由碱基的取代、缺失或添加所致。“白蛋白”是哺乳动物血浆中天然存在的蛋白质，其中它是丰度最高的蛋白质。它在维持血液的所需渗透压，以及另外在血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以白蛋白启动子驱动的表达载体，其特征在于：所述表达载体包含表达框，所述表达框从5’端到3’端依次包含白蛋白启动子及其第一个内含子、白蛋白基因、内核糖体进入位点序列IRES、第二基因。

【技术特征摘要】
1.一种以白蛋白启动子驱动的表达载体，其特征在于：所述表达载体包含表达框，所述表达框从5’端到3’端依次包含白蛋白启动子及其第一个内含子、白蛋白基因、内核糖体进入位点序列IRES、第二基因。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述白蛋白启动子是人血清白蛋白启动子。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述白蛋白基因选自人血清白蛋白基因、狗血清白蛋白基因、猫血清白蛋白基因、牛血清白蛋白基因、羊血清白蛋白基因、猪血清白蛋白基因、马血清白蛋白基因、鼠血清白蛋白基因、猴血清白蛋白基因、兔血清白蛋白基因，优选地，所述白蛋白基因是人血清白蛋白基因。4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述第二基因是筛选标记基因。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述筛选标记基因选自谷氨酰胺合成酶基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因、嘌呤霉素抗性基、绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述筛选标记基因是人谷氨酰胺合成酶基因或绿色荧光蛋白基因。7.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述表达框还包含其它调控元件。8.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体还包含骨架。9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于：所述骨架选自逆转录病毒、慢病毒与腺病毒骨架，优选地，所述骨架是慢病毒骨架。10.根据权利要求1-9任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱颂成，倪华，赵晓梅，
申请(专利权)人：上海安民生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31