一种低成本的超分辨显微镜制造技术

本实用新型专利技术涉及一种低成本的超分辨显微镜，包括激光发射器及沿激光发射器发射激光光路设置的中心密度滤波器、第一凸透镜、散射片、第二凸透镜、第三凸透镜、双色镜、物镜、激发光滤波器、平场透镜和CMOS图像传感器；本实用新型专利技术利用工业级的二极管激光器、低数值孔径的物镜和工业级的相机在基本保证显微镜分辨率的条件下，很好地解决了成本问题，让超分辨技术能够得到更为广泛的应用，更好的推进科学的发展。

A Low Cost Super Resolution Microscope

The utility model relates to a low-cost super-resolution microscope, which comprises a laser emitter and a central density filter, a first convex lens, a scatterer, a second convex lens, a third convex lens, a bichrome lens, an objective lens, an excitation light filter, a flat-field lens and a CMOS image sensor arranged along the laser emitter light path; the utility model utilizes an industrial-grade diode laser. Low numerical aperture objective lens and industrial-grade camera can solve the cost problem well under the condition of ensuring the resolution of the microscope, so that the super-resolution technology can be more widely used and better promote the development of science.

【技术实现步骤摘要】
一种低成本的超分辨显微镜
本技术属于光学
，涉及一种低成本的超分辨显微镜。
技术介绍
荧光显微镜极大地提高了我们在细胞和亚细胞水平上研究生物过程的能力。然而，由于受到衍射极限的束缚，传统的荧光显微镜的空间分辨率极限大约在200纳米。直至近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，光学成像的分辨率得到了极大的改进，达到可以与电子显微镜相媲美的精度，并可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质。超分辨技术大致可以分为两类，一种是以受激发射损耗显微镜(STED)和结构光照明显微镜(SIM)为代表的利用非线性光技术实现超分辨。STED的基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率。改变光学点扩散函数来突破光学极限的另一种方法是利用饱和结构照明显微技术(SIM)，其基本原理是将多重相互衍射的光束照射到样品上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息。但STED和SIM都是基于非线性光学效应，都需要较高功率的脉冲激光，这可能导致损坏样品。并且其光路复杂、设备昂贵，对系统的稳定性要求很高。另一种是以光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重构显微镜(STORM)为代表的基于单分子定位实现超分辨。其中PALM的基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光分子，在确定这些分子的位置后，再长时间用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使得他们不能够被下一轮的激光再激活出来。之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位，将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术。PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力。与PALM类似，STORM利用不同的波长控制化学荧光分子Cy5在荧光激发态和暗态之间切换，例如红色561nm的激光可以激活Cy5发射荧光，同时长时间照射可以将Cy5分子转换成暗态不发光。之后，用绿色的488nm激光照射Cy5分子时，可以将其从暗态转换成荧光态，而此过程的长短依赖于第二个荧光分子Cy3与Cy5之间的距离。因此，当Cy3和Cy5偶联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性。将Cy3和Cy5分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白。其横向分辨率能够达到20～30nm。上述这些超分辨技术都使得光学显微镜的分辨率大大提高，但是它们高昂的成本也限制了它们的使用范围，只有少部分相关专业的研究所拥有这些显微镜，大部分研究所和高校都无法承受这样的高成本。超分辨技术的关键技术要求主要有三个方面，一是需要有一个科研级的激光器作为激光光源，提供平顶光束或者激活特定的荧光分子；二是需要一个高数值孔径的物镜，以收集更多的激发光子，增加成像的对比度，使成像更为清晰；三是需要一个足够灵敏的、高信噪比的光学探头，以收集微弱的荧光信号。这三者使得超分辨显微镜的总费用高达数十万美元。所以亟需研究出一种低成本新的超分辨显微镜很好地解决了成本问题。
技术实现思路
有鉴于此，本技术的目的克服现有技术的缺点和不足，通过对光路的重新设计，采用价格低廉的设备实现超分辨显微技术，提供一种低成本的超分辨显微镜。为达到上述目的，本技术提供如下技术方案：一种低成本的超分辨显微镜，包括激光发射器及沿激光发射器发射激光光路设置的中心密度滤波器、第一凸透镜、散射片、第二凸透镜、第三凸透镜、双色镜、物镜、激发光滤波器、平场透镜和CMOS图像传感器；所述激光发射器发射激光经中心密度滤波器滤波后到达第一凸透镜，然后聚焦在散射片上，随后依次通过第二凸透镜和第三凸透镜，再经双色镜分光后，双色镜反射的激光到达物镜聚焦在样品上，激发样品中的荧光物质，使其发射激发光，激发光通过物镜收集后，透过双色镜到达激发光滤波器，再透过平场透镜最后到达CMOS图像传感器成像。进一步，所述激光发射器为工业级二极管激光发射器，其发射光束为非高斯光束。进一步，所述第一凸透镜、所述第二凸透镜和所述第三凸透镜均为消色差双胶合透镜。进一步，所述散射片通过直流电机进行驱动，并处于所述第一凸透镜、所述第二凸透镜及所述第三凸透镜的焦平面处。进一步，所述物镜为数值孔径为1.3的物镜。进一步，所述CMOS图像传感器为工业级CMOS图像传感器。进一步，以上任一项所述的低成本的超分辨显微镜，还包括XY平移台和承载样品的样品台，所述样品台设置于所述XY平移台上，所述XY平移台的移动带动所述样品台运动，以调节所述样品与所述物镜之间的相对位置。进一步，还包括底座、支柱、透镜套筒及滤光片立方框，所述XY平移台通过支柱与所述底座相连接，所述CMOS图像传感器设置于所述底座上，所述物镜、所述滤光片立方框及所述透镜套筒依次连接，所述透镜套筒与所述CMOS图像传感器相连接，所述双色镜及所述激发光滤波器设置于所述滤光片立方框内，且所述激发光滤波器位于所述双色镜与所述CMOS图像传感器之间，所述平场透镜设置于所述透镜套筒内。进一步，还包括Z轴调节器，所述物镜通过所述Z轴调节器与所述滤光片立方框相连接，所述Z轴调节器用于调节所述物镜与所述样品台之间的距离。进一步，还包括防震底座，所述防震底座设置于所述底座远离所述样品台的一侧。本技术的有益效果在于：本技术利用工业级的二极管激光器、低数值孔径的物镜和工业级的相机在基本保证显微镜分辨率的条件下，很好地解决了成本问题，让超分辨技术能够得到更为广泛的应用，更好的推进科学的发展。附图说明为了使本技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本技术提供如下附图进行说明：图1是本技术超分辨显微镜整体结构三维示意图；图2是本技术超分辨显微镜整体正视图；图3是本技术超分辨显微镜光路图；图4是所述激光器的点扩散函数图，表明激光器所发射光源的均匀性；图5是金纳米颗粒的超分辨成像结果图；图6是原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)微管成像结果图；图7是对图6的局部放大结果图；图8是量子产率比较图。其中图1中：1激光发射器；2中心密度滤波器；3第一凸透镜；4直流电机；5散射片；6第二凸透镜；7第三凸透镜；8镜片卡口；9光学支柱；10接杆支架；11样品台；12XY平移台；13物镜；14Z轴调节平台；15滤光片立方框；16双色镜；17激发光滤波器；18镜筒支柱；19平场透镜；20透镜套管；21螺纹接头；22CMOS图像传感器；23光学支柱；24显微镜底座；25防震底座；26光学面板。具体实施方式为使本技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本技术。但是本技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本技术内涵的情况下做类似改进，因此技术不受下面公开的具体实施的限制。需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低成本的超分辨显微镜，其特征在于，包括激光发射器及沿激光发射器发射激光光路设置的中心密度滤波器、第一凸透镜、散射片、第二凸透镜、第三凸透镜、双色镜、物镜、激发光滤波器、平场透镜和CMOS图像传感器；所述激光发射器发射激光经中心密度滤波器滤波后到达第一凸透镜，然后聚焦在散射片上，随后依次通过第二凸透镜和第三凸透镜，再经双色镜分光后，双色镜反射的激光到达物镜聚焦在样品上，激发样品中的荧光物质，使其发射激发光，激发光通过物镜收集后，透过双色镜到达激发光滤波器，再透过平场透镜最后到达CMOS图像传感器成像。

【技术特征摘要】
1.一种低成本的超分辨显微镜，其特征在于，包括激光发射器及沿激光发射器发射激光光路设置的中心密度滤波器、第一凸透镜、散射片、第二凸透镜、第三凸透镜、双色镜、物镜、激发光滤波器、平场透镜和CMOS图像传感器；所述激光发射器发射激光经中心密度滤波器滤波后到达第一凸透镜，然后聚焦在散射片上，随后依次通过第二凸透镜和第三凸透镜，再经双色镜分光后，双色镜反射的激光到达物镜聚焦在样品上，激发样品中的荧光物质，使其发射激发光，激发光通过物镜收集后，透过双色镜到达激发光滤波器，再透过平场透镜最后到达CMOS图像传感器成像。2.根据权利要求1所述的低成本的超分辨显微镜，其特征在于，所述激光发射器为工业级二极管激光发射器，其发射光束为非高斯光束。3.根据权利要求1所述的低成本的超分辨显微镜，其特征在于，所述第一凸透镜、所述第二凸透镜和所述第三凸透镜均为消色差双胶合透镜。4.根据权利要求1所述的低成本的超分辨显微镜，其特征在于，所述散射片通过直流电机进行驱动，并处于所述第一凸透镜、所述第二凸透镜及所述第三凸透镜的焦平面处。5.根据权利要求1所述的低成本的超分辨显微镜，其特征在于，所述物镜为数值孔径为1.3的物镜。6.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王富，
申请(专利权)人：宁波蔡康光电科技有限责任公司，
类型：新型
国别省市：浙江,33