单纯疱疹病毒I型和II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及病原微生物的检测技术领域，尤其涉及单纯疱疹病毒I型和II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法。发明专利技术以HSV基因组中反向重复序列RL2、RS1为靶标区域，一方面基因组内有2个拷贝，可进一步提高检测灵敏度，另一方面型间核酸相似度低，不易造成交叉反应。

Detection Markers, Primer Probe Pairs, Kits and Detection Methods of Herpes Simplex Virus Type I and Type II

The invention relates to the detection technology field of pathogenic microorganisms, in particular to herpes simplex virus type I and II detection markers, primer probe pairs, kits and detection methods. The invention uses reverse repetitive sequences RL2 and RS1 in HSV genome as target regions. On the one hand, there are two copies in the genome, which can further improve the detection sensitivity, on the other hand, the similarity of nucleic acids between genotypes is low and it is not easy to cause cross-reactions.

【技术实现步骤摘要】
单纯疱疹病毒I型和II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及病原微生物的检测
，尤其涉及单纯疱疹病毒I型和/或II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法。
技术介绍
单纯疱疹是一种由单纯疱疹病毒所致的病毒性皮肤病，能引起人类多种疾病，如龈口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染。单纯疱疹病毒(HSV)属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。根据抗原性的差别目前把该病毒分为I型(HSV-1)和II型(HSV-2)。HSV-1主要由口唇病灶获得，也可在生殖器病灶分离得到，HSV-2可从生殖器病灶分离到。感染是由于人与人的接触，是最易侵犯人的一种病毒，但在临床仅有一部份发病。此病可分为：口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹、卡波西病等，有时也是脑膜炎、脑炎的病因。HSV可通过胎盘感染，影响胚胎细胞分裂，造成流产、胎儿畸形、智力低下等先天性疾病，新生儿在通过HSV-2感染的产道时会被感染，出现高热、呼吸困难和中枢神经系统病变。必要的产检并且进行早期抗感染治疗，可以有效减少HSV-2患者将病毒传播给下一代。HSV基因组为一线性DNA分子，由共价连接的长片段(L)和短片段(S)组成，每片段均含有单一序列和反转重复序列，其中长片段单一序列分别为UL1-UL56，另有2条命名为UL26.5和UL49A，长片段反转重复序列分别为RL1和RL2，短片段单一序列分别为US1-US12，另有1条命名为US8A，短片段反转重复序列为RS1。基因组共编码70多种各异的蛋白质，其中除24种蛋白的特性还不清楚外，有18种编码蛋白组成病毒DNA结合蛋白及各种酶类，参与病毒DNA合成，包装及核苷酸的代谢等。30多种不同蛋白组成病毒结构蛋白(如衣壳蛋白、囊膜蛋白)，在保护HSV的DNA，以及HSV的致病作用和诱导机体免疫应答中起重要作用。目前，单纯疱疹病毒的检测方法主要有细菌的分离培养、免疫学诊断和分子生物学诊断，三种方法具有以下特点：1)病毒分离培养是当今临床上明确诊断疱疹病毒感染的可靠依据。可采集皮肤、生殖器等病变部位的水疱液、脑脊液、角膜刮取物、唾液等标本，接种人二倍体成纤维细胞株WI38及其它传代细胞株如Vero、BHK等，经24～48小时后，细胞则出现肿胀、变圆、细胞融合等病变。病毒分离培养时间周期长、操作繁琐、需要专业操作人员和严苛的实验室条件，因此临床快速诊断方面应用很少。2)免疫学诊断诊断还存在滞后性，不能准确反映当前是否感染或携带病原体，难以满足早期诊断的要求。3)病原体核酸检测：具有快速、准确、检测窗口短、高灵敏度等优点，能够对病原物作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中实时定量PCR检测平台已成为最简捷和可靠的核酸检测方法，在目前国内外的核酸诊断中应用最为广泛，检测原理为，检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光，引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比，可实时监控扩增情况。目前产品大部分采取针对HSV-1/HSV-2单一的荧光定量PCR检测方法，必须对一个临床样本进行分管检测，才能分别得出结论，增加了检测成本和操作繁琐度。国内外已有大量报道，介绍HSV-1/HSV-2核酸分型检测，应用到的靶标主要包括：糖蛋白G(US4，核酸相似度78.4％)、糖蛋白J(US5，核酸相似度69.8％)、糖蛋白D(US6，核酸相似度79.2％)、糖蛋白I(US7，核酸相似度69.6％)、糖蛋白E(US8，核酸相似度67.3％)、糖蛋白B(UL27，核酸相似度77.3％)、DNA聚合酶(UL30，核酸相似度89.1％；UL42，核酸相似度76.6％)、胸苷激酶(UL23，核酸相似度79.9％)等。以上靶基因均为单拷贝，由于丰度不足，在检测过程中易造成漏检。而由于两种HSV型间核酸相似度均在65％以上，甚至有些基因的相似度高达80％～90％。HSV-1与HSV-2两者之间的高相似度，造成了对HSV分型检测的困难。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供单纯疱疹病毒I型和/或II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法。本专利技术提供了区分HSV-1病毒和HSV-2病毒的引物、探针组，其包括SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的2条引物；SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的2条引物；SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针；SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针。所述SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；所述SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。本专利技术所述的引物和探针分别针对HSV-1的RL1片段和HSV-2的RS1片段设计，具有良好的准确性、灵敏度、特异性，即便在同一个扩增体系中进行检测，也能够良好的区分HSV的I型和II型。其最低检测限可达5拷贝。本专利技术所述的探针的荧光报告基团选自FAM、JOE或HEX或VIC、ROX、CY3或CY5、TexasRed；荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1、MGB和TAMRA。本专利技术实施例中，所述HSV-1病毒检测探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ3。所述HSV-2病毒检测探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。本专利技术还提供了一种检测并区分HSV-1病毒和HSV-2病毒的试剂盒，其包括：SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的2条引物；SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的2条引物；SEQIDNO:3所示的探针；SEQIDNO:6所示的探针。本专利技术所述的试剂盒中，还包括荧光定量PCR检测试剂和/或样本提取试剂；所述荧光定量PCR检测试剂包括qPCRMasterMix酶混合液和qPCRMasterMix反应缓冲液。所述样本提取试剂包括NaOH、TritonX-100和TE缓冲液。所述qPCRMasterMix酶混合液，包括Taq酶和UNG酶，所述的Taq酶为AnstartTaqDNA聚合酶，所述的UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。所述样本提取液包括NaOH终浓度为0.01％～0.5％，优选为0.1％。所述样本提取液包括TritonX-100终浓度为0.01％～0.5％，优选为0.1％。进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。本专利技术的阴性对照品为DEPC水。本专利技术的阳性对照品为含有HSV-1靶基因片段的质粒溶液。所述HSV-1特异性靶基因片段序列为：GGTGCTGATTGACGCGGGAAATCCCCCCCCATTCTTACCCGCCCCCCTTTTTTCCCCTTAGCCCGCCCCGGATGTCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGCCGGACAGCAG(SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.区分HSV‑1病毒和HSV‑2病毒的引物、探针组，其包括SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的2条引物；SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的2条引物；SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针。

【技术特征摘要】
1.区分HSV-1病毒和HSV-2病毒的引物、探针组，其包括SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的2条引物；SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的2条引物；SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针；SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针。2.根据权利要求1所述的引物、探针组，其特征在于，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。3.一种检测并区分HSV-1病毒和HSV-2病毒的试剂盒，其包括权利要求1或2所述的引物、探针组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括对内参基因HBB检测的引物对和探针；所述针对内参基因HBB检测的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:7～8所示；所述针对内参基因HBB检测的探针的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，SEQIDNO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏颖颖，蔺皓，邹国宝，刘欣欣，宋高尚，沈江卫，吴茜，
申请(专利权)人：中生方政生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32