一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物及其方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物及其方法；旨在提供特一种异性强、灵敏性高、重复性好的快速检测鲤鱼浮肿病毒检测引物和方法；其技术方案包括引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示的引物；检测方法为：1)从临床样本中提取病毒基因组DNA；2)以抽提的样本DNA为模板，使用权利要1所述的引物组，权利要求2探针配制RPA反应体系，采用TwistAmp exo试剂盒进RPA扩增反应；3)将RPA扩增后的反应管置于荧光检测仪中，实时监测荧光信号，如果有明显的荧光信号曲线，则说明样本中含有CEV，如无荧光信号曲线，则说明样本中不含有CEV；本发明专利技术属于动物的病原检测领域。

A Primer for Rapid Detection of Carp Edema Virus and Its Method

The invention discloses a primer for rapid detection of carp edema virus and a method thereof; aims to provide a special primer and method for rapid detection of carp edema virus with strong specificity, high sensitivity and good repeatability; the technical scheme includes primer nucleotide sequences such as SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:3; the detection method is as follows: 1) extracting virus gene from clinical samples; Group DNA; 2) Take extracted sample DNA as template and use primer group mentioned in right 1, claim 2 probe to prepare RPA reaction system, and use Twist Amp exo kit for RPA amplification reaction; 3) Place RPA amplified reaction tube in fluorescence detector to monitor fluorescence signal in real time. If there is obvious fluorescence signal curve, it shows that there is CEV in the sample, such as no fluorescence signal curve. The invention belongs to the field of animal pathogen detection.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物及其方法
本专利技术属于动物的病原检测领域，具体涉及快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物及其方法。
技术介绍
鲤鱼浮肿病(carpedemavirusdisease)是一种感染鲤和锦鲤的重要传染病，病原为鲤鱼浮肿病毒(carpedemavirusCEV)，根据1997年Oyamatsu和Hata等人和2005年Miyazaki,Isshiki,和Katsuyuki等人提出其病原致病因子假定是痘病毒科的双链DNA病毒，临床上表现为嗜睡，皮肤出血伴下层组织水肿，眼球内陷和苍白肿胀的鳃，类似于锦鲤疱疹病毒(KoiherpesvirusKHV)的临床症状。鲤鱼浮肿病最早于1970年在日本发现，近几年CEV频发，在几个欧洲国家和印度、日本、中国、美国出现爆发性死亡现象。自2002年我国在广东发现该病以来，不断在国内多个养殖场发现，该疾病可能导致锦鲤和鲤鱼种群的高死亡率，发病范围广。因为在临床上难以区分锦鲤疱疹病毒，加上为了进一步防止感染和疾病的传播，需要一种可靠的检测方法。目前，实验室检测方法主要是普通PCR、实时荧光PCR，然而这些操作复杂且不够快捷，还会产生昂贵的费用。因此，建立一种快速、有效的临床检测方法对临床诊断、监测、和流行病毒调查具有重要意义。重组酶聚合酶扩增(RecombinasepolymeraseamplificationRPA)是近年来发展起来的一种快速诊断不同病原的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断研究。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，ssDNA结合蛋白稳定非模板链的置换，并用链置换聚合酶进行启动互补DNA链合成。整个过程仅需在37-42℃下反应20-40分钟即可。与普通PCR相比，整个过程不需要高温变性和低温退火，反应简单、快速高效。与荧光定量PCR相比，不需要昂贵的仪器。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内，目前基于RPA扩增产物进行检测的方法主要有三种形式：RPA与琼脂糖凝胶检测技术相结合(基础型RPA)、RPA与荧光检测技术相结合(realtimeRPA)、RPA与侧向流动免疫技术相结合(LFD-RPA)。目前国际上尚无采用realtimeRPA检测CEV的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏性高、重复性好的快速检测鲤鱼浮肿病毒检测用引物和探针。本专利技术的另一目的在于提供快速检测鲤鱼浮肿病毒检测方法。为此，本专利技术提供的第一个技术方案为：一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物，其核苷酸序列如下所示：CEV-RPA-F：5`-GTATGGAATTAAGGCATACACTTATTCTCC-3`(SEQIDNO：1)；CEV-RPA-R：5`-TTGACGAGGGAATGATTGAGACAAAGTAGA-3`(SEQIDNO：2)。一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的探针，其核苷酸序列如下所示：CEV-RPA-P：5`-GCTACAATTCCAAGAGCATAATGATATTCAAGA(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)AGTCTAATTTGATCT-(C3spacer)-3`(SEQIDNO：3)。本专利技术提供的第二个技术方案为：一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的方法，依次包括下述步骤：1)从临床样本中提取病毒基因组DNA；2)以抽提的样本DNA为模板，使用核苷酸序列如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的引物组和探针配制RPA反应体系，采用TwistAmpexo试剂盒进RPA扩增反应；3)将RPA扩增反应管置于荧光检测仪中，实时监测荧光信号，如果有明显的荧光信号曲线，则说明样本中含有CEV，如无荧光信号曲线，则说明样本中不含有CEV。优选的，上述的一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的方法，所述的RPA扩增反应的体系为：优选的，上述的一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的方法，所述的扩增反应温度39℃，时间20min。优选的，上述的一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的方法，所述的恒温荧光检测仪为Deaou-308c恒温荧光检测仪。本专利技术的有益效果是：1、本申请提供的技术方案采用RealtimeRPA技术通过荧光信号检测仪测量exo探针产生的荧光信号，无需琼脂糖凝胶，也无需侧流层析检测试纸，闭管操作进一步避免了气溶胶污染的问题。同时灵敏度也要高于琼脂糖凝胶法。2、本申请提供的技术方案筛选不同的引物探针组合特异性扩增CEV基因，优化反应条件，并验证方法的特异性、灵敏性、重复性，建立了一种早期、快速现场诊断鲤鱼浮肿病毒的方法。附图说明图1是RPA试验灵敏度曲线图；图2是RPA和PCR灵敏度对图。图3是特异性实验曲线图。具体实施方式下面结合附图说明和具体实施方式对本专利技术的权利要求做进一步的详细说明。实施例11、病毒的提取将感染了测鲤鱼浮肿病毒的鱼组织按TIANGEN公司TIANampGenomicDNAKit试剂盒说明书进行提取DNA。2、引物的设计根据GenBank中CEV(GenBank:MG550029.1)公布的序列，设计PCR引物，扩增P4a序列。反应体系为：rTaq酶20μL，上游引物(SEQIDNO：1)2μL，下游引物(SEQIDNO：2)2μL，模板DNA(步骤1提取的DNA)2μL，用dH2O14μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃再延伸10min；12℃保存。通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR目的产物，按照OMEGA公司E.Z.N.A.GelExtractionKit试剂盒说明书进行回收。3、目的基因的克隆将4.5μL回收产物与0.5μLpMD-18Tvector、5μLsolutionI总体积共10μL混匀，放4℃连接过夜。将10μL连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞中，转化步骤为：将10μL连接产物加入100μL感受态细胞中轻轻混匀，冰上冰浴30min；金属浴42℃热激90Sec后冰浴5min；加入1mLLB培养基后在200rpm，37℃的摇床上摇1h；涂布含有氨苄青霉素抗性的平板，挑取单克隆菌落扩大培养做PCR鉴定挑选阳性菌落。提质粒：按照OMEGA公司的E.Z.N.A.PlasmidMiniKitI试剂盒说明书进行提取。将提取后的质粒送至上海生工生物股份有限公司广州分公司测序。4、RPA引物与探针的设计本申请CEVP4a基因序列设计了RPA引物和探针，以扩增特定的片段。real-timeRPA引物探针的设计是依据TwistAmpTM(TwistDX，英国)中的说明书进行操作。首先设计探针，按照试剂盒中exo-probe的设计原则；首先找到一对碱基核苷酸T，这对T碱基被1-5个碱基隔开，靠近5'端T碱基被荧光基团取代，3'端T碱基被淬灭基团取代(也可是5'端T碱基淬灭基团，取代3'端T碱基被荧光基团取代)，在隔开的中间碱基中挑一个碱基用THF取代；从5’端到荧光基团至少30个碱基，从3’端到淬灭基团至少15个碱基；且3’端碱基需要被C3spacer封闭。而RPA的引物长度控制在30-35nt，并通过blast验证引物特异性，扩增片段在100-300bp内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：CEV‑RPA‑F：5`‑GTATGGAATTAAGGCATACACTTATTCTCC‑3`(SEQ ID NO：1)；CEV‑RPA‑R：5`‑TTGACGAGGGAATGATTGAGACAAAGTAGA‑3`(SEQ ID NO：2)。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的引物，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：CEV-RPA-F：5`-GTATGGAATTAAGGCATACACTTATTCTCC-3`(SEQIDNO：1)；CEV-RPA-R：5`-TTGACGAGGGAATGATTGAGACAAAGTAGA-3`(SEQIDNO：2)。2.一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的探针，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：CEV-RPA-P：5`-GCTACAATTCCAAGAGCATAATGATATTCAAGA(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)AGTCTAATTTGATCT-(C3spacer)-3`(SEQIDNO：3)。3.一种快速检测鲤鱼浮肿病毒的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：董建国，胡明明，王华南，丛潇，杨忠艳，左晓，
申请(专利权)人：广州动佰生物科技有限公司，信阳农林学院，山西省动物疫病预防控制中心，浙江大学，
类型：发明
国别省市：广东,44