一种高密度遗传连锁图谱的快速构建方法技术

本发明专利技术提供一种快速、低成本的构建高密度遗传连锁图谱的方法，其步骤包括亲本杂交F1代种子收集、种子子叶中微量DNA多重置换扩增、简化基因组测序以及基因分型，最后基于拟测交策略使用遗传连锁图谱构建软件即可获得植物的高密度遗传连锁图谱。本发明专利技术的优点在于直接使用杂交F1代种子即可用于构建高密度遗传连锁图谱，耗时短，成本低；一方面克服了杨梅栽培品种间杂交种子萌发困难、生长发育耗时长的障碍，而且可以较低成本构建较高密度的遗传图谱。该方法为应用多年生林木作为亲本杂交以及子代种子较难萌发的群体进行遗传连锁图谱构建提供了新的思路和方法，加速了此类植物的高密度遗传图谱构建进程。

A Rapid Construction Method of High Density Linkage Map

The invention provides a fast and low-cost method for constructing high-density genetic linkage map. The steps include collecting seeds of F1 generation of parent hybridization, multiplex replacement and amplification of trace DNA in seed cotyledons, simplifying genome sequencing and genotyping. Finally, high-density genetic linkage map of plants can be obtained by using genetic linkage map construction software based on the strategy of pseudo-crossing. The advantages of the present invention are that the hybrid F1 seeds can be directly used to construct a high density genetic linkage map with short time and low cost; on the one hand, it overcomes the obstacles of difficult germination and long growth and development of hybrid seeds among Myrica rubra cultivars, and can construct a high density genetic map at low cost. This method provides a new idea and method for the construction of genetic linkage map using perennial trees as parent hybrids and populations whose seeds are difficult to germinate, and accelerates the construction of high-density genetic map of such plants.

【技术实现步骤摘要】
一种高密度遗传连锁图谱的快速构建方法
本专利技术涉及一种基于杂交F1代作图群体的高密度遗传连锁图谱快速构建方法，属于分子遗传学领域。
技术介绍
杨梅(MyricarubraSieb.andZucc.)是原产于我国南方的特色果树，其种质资源丰富，有2000多年的栽培历史，果实富含花色素苷，具有较高的营养价值，鲜食与加工兼宜，市场潜力巨大。据全国杨梅科研、生产协作组等有关单位的调查和整理的结果表明，我国杨梅共有305个品种，单系120个，现已定名的品种共268份(庄卫东，2001)。尽管我国有着丰富的杨梅种质资源，但是新品种的来源还仅限于自然产生的优良变异类型，通过人工杂交方式选育新品种还未见报道。究其原因，主要是由于杨梅作为多年生林木，生长发育周期较长，从种子发芽到结果通常需要8-10年时间；再者，杨梅种子具有休眠性，生理后熟机制较为复杂；在自然状态下，通常栽培品种种子发芽率比实生树的种子发芽率低很多，例如杨梅著名品种‘荸荠’和‘东魁’的种子发芽率仅为5％-27％；即便是使用低温层积、硝酸钾、硫酸、赤霉素、双氧水、热水浸种等各种处理之后，其作用效果也非常有限；另外，有些杨梅品种即使经过不同催芽处理，其种子在采收当年也基本不能萌发，要持续2-3年后部分种子才可以萌发；总之，上述原因是杨梅进行杂交育种与杂交群体构建工作进程中的重要障碍。遗传连锁图谱以遗传标记间的重组率为基础对染色体上的遗传标记或者已知基因进行相对定位，也是进行资源研究的理论基础和依据，因此，构建遗传连锁图谱可为控制重要农艺性状基因、数量性状的位点进行定位及检测和分析服务。早期形态标记是构建遗传连锁图谱主要方法，随着分子生物学特别是分子标记技术的发展，RAPD、AFLP、SSR、SNP等分子标记方法被广泛应用于遗传连锁图谱的构建中。其中，SNP(Singlenucleotidepolymorphism)具有数量多、分布广泛、稳定性好等优点，利用SNP标记进行多年生果树高密度遗传连锁图谱的构建已被广泛使用(Wangetal.,2011)。然而，遗传图谱构建的基础是分离群体，适合的亲本和适当的群体是成功和高效作图的关键。果树多数为多年生异交植物，多数自交不亲和，基因型高度复杂，有性时代太长，因而很难通过杂交获得纯系，因此，利用近交系或其他高世代群体进行遗传构图是非常困难的。近年来在林木图谱构建中发展出来拟测交策略，其原理是将两个杂合体双亲均看作回交一代群体，并将对方作为测交隐性亲本，即以亲缘关系相对较远的杂合亲本交配所得的Fl为作图群体，因亲本杂合，由于亲本杂交得到F1代群体遗传位点已经产生分离重组，可以直接选取在亲本中呈多态且在F1中以1∶1分离的位点来模拟近交系中的测交位点作图。针对杨梅而言，其在分子遗传尤其是育种领域的研究仅处于起步阶段，基础较为薄弱。就杨梅而言，由于杂交种子生理后熟机制复杂，萌发困难，耗时较长，即使利用低世代(F1代)杂交群体及拟测交策略构建遗传图谱，从亲本杂交授粉、种子收集与播种到种子萌发然后采集叶片进而提取DNA通常也需要2-3年时间，严重限制了杨梅的遗传图谱构建及其他分子遗传学相关研究工作的开展。因此，探索利用较为快捷的技术方法进行杨梅遗传图谱的构建是克服现有技术方法不足的有效途径之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速的基于杂交F1作图群体的高密度遗传连锁图谱的构建方法。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：(1)杨梅栽培品种杂交授粉：选择农艺性状、果实品质具有一定差异的杨梅栽培品种作为亲本开展杂交授粉，MyricaL.首先在(母本)杨梅雌花始花期前10天，使用硫酸纸袋将着生雌花的枝条进行套袋隔离，套袋的花序总数量需>100个；然后，在雄花盛花期收集(父本)杨梅雄花的花粉，置于4℃保存备用；待(母本)杨梅雌花盛花期时，拆开套袋一角，用毛笔蘸取少量(父本)杨梅雄花的花粉进行人工点授，授粉后将袋子上的孔用胶带再次密封隔离；最后，待果实进入膨大期将硫酸纸袋拆掉换成纱网袋并挂牌标记，可防止果实落果造成的损失；待果实完熟后直接收集所有纱网袋中杂交果实，将去除果肉后种子阴干后置于4℃冰箱保存。其中选择杨梅杂交亲本的具体条件为：1、两个亲本均为杨梅属(MyricaL.)杨梅种(Myricarubra)内栽培品种，两者果实成熟期早晚差异大于10d以上，同时果实平均单果重差异大于8g以上；2、由于杨梅为雌雄异株植物，两个亲本中必须至少有一个可以产生花粉(作为父本)才可以形成有效杂交授粉组合。以上两个条件均需满足。(2)杂交F1种子处理与样品收集：种子直接使用坚果破壳器将每粒种子的硬质外壳压碎后去除；然后使用手术刀和镊子在超净工作台上小心翼翼的撕开核仁的黄褐色外皮，同时只刮取少量种子子叶部分样品(>50mg)置于2ml圆底具塞离心管内，每份子叶样品均单独存放，每份样品采集处理前后手术刀、镊子等都要用医用酒精擦拭后火焰灼烧以防止交叉污染；(3)子叶中微量DNA的提取与纯化：①在每份装有子叶样品的离心管内加入一粒钢珠，用液氮浸泡后置于FastPrep-96高通量样品制备仪上进行充分研磨(亲本可直接采集少许嫩叶同步进行研磨及相关DNA提取)；然后，直接加入1mL65℃预热的CTAB提取液后混匀(提取液的配方为：CTAB，4g；NaCl，16.34g，1MTris·HCl(pH8.0)，20ml；0.5MEDTA，8ml；3％PVP，2g；定容于200ml，调整pH至8.0，灭菌后即可使用)，置于65℃金属浴上保持45min后加入等体积抽提混合液(氯仿：乙醇：异戊醇＝20：4：1，体积比)，震荡混匀；②12000rpm离心10min，小心吸取上层水相于干净离心管中，加入等体积抽提混合液后震荡混匀，12000rpm离心10min，再次小心吸取上层水相于干净离心管中；然后加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置40min，12000rpm离心10min，去上清液，加入500μL70％乙醇，涡旋震荡，12000rpm离心10min，去上清液，吸取残留液体并晾干DNA沉淀，加入50μLTE溶液溶解(TE溶液的配方为：10mmol/LTris·Cl，1mmol/LEDTA，pH8.0)；③使用微量DNA纯化试剂盒MicroDNAClean-UpKit(OMEGA)纯化上述DNA粗提液；具体操作步骤如下：DNA粗提液加0.5倍体积的BufferP3和等体积无水乙醇，室温下充分混匀；混合液在10000rpm离心1min条件下通过DNA吸附柱；弃去过滤液，将吸附柱放回原管，加入700μLSPW后10000rpm离心1min，弃过滤液后再次加入700μLSPW清洗吸附柱；将吸附柱放回原管，13000rpm离心2min以彻底去除各种残留液体；最后将吸附柱套入1.5ml离心管中加入20μLddH2O，13000rpm离心2min洗脱吸附柱中DNA，重复洗脱1次；取2～5μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，置于-80℃冰箱保存备用；(4)微量DNA多重置换扩增：①样品加热变性及引物与质粒退火反应：ddH2O4.4μl，10×phi29DNA聚合酶缓冲液1.0μl，随机引物(100μM)2.5μl(序列为：NNNNNN，经硫代磷酸化修饰)，DNA模本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：A、栽培品种杂交授粉：始花期前将母本的雌花花序隔离，父本的花粉授到母本的雌花上继续隔离，待杂交果实成熟后收集杂交F1种子；B、杂交F1种子处理与样品收集：杂交F1种子破壁后取种子子叶部分作为样品；C、提取与纯化子叶中的微量DNA；D、多重置换扩增方法处理子叶中的微量DNA，获得多个扩增后的DNA样品；E、真假杂种鉴定：对扩增后的DNA样品进行PCR扩增，PCR扩增结果在遗传分析仪上鉴定其片段大小，最后对父、母本及杂交群体进行对比分析，若后代群体扩增出条带大小与父母本完全一致即为真杂种，扩增出其他片段大小的后代均为假杂种，直接剔除；F、通过鉴定后的真杂种DNA进行测序，绘制高密度遗传连锁图谱。

【技术特征摘要】
1.一种高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：A、栽培品种杂交授粉：始花期前将母本的雌花花序隔离，父本的花粉授到母本的雌花上继续隔离，待杂交果实成熟后收集杂交F1种子；B、杂交F1种子处理与样品收集：杂交F1种子破壁后取种子子叶部分作为样品；C、提取与纯化子叶中的微量DNA；D、多重置换扩增方法处理子叶中的微量DNA，获得多个扩增后的DNA样品；E、真假杂种鉴定：对扩增后的DNA样品进行PCR扩增，PCR扩增结果在遗传分析仪上鉴定其片段大小，最后对父、母本及杂交群体进行对比分析，若后代群体扩增出条带大小与父母本完全一致即为真杂种，扩增出其他片段大小的后代均为假杂种，直接剔除；F、通过鉴定后的真杂种DNA进行测序，绘制高密度遗传连锁图谱。2.根据权利要求1所述的高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，步骤A具体为：在母本雌花始花期前进行套袋隔离，套袋的花序总数量>100个；然后在雄花盛花期收集父本雄花的花粉，冷藏保存备用；待母本雌花盛花期时，进行人工点授，授粉后雌花再次密封隔离；待果实完熟后收集所有杂交果实，去除果肉，杂交F1种子阴干后冷藏保存。3.根据权利要求2所述的高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，步骤A中待果实进入膨大期将纸袋拆掉换成纱网袋并挂牌标记。4.根据权利要求2所述的高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，步骤B具体为：使用坚果破壳器将每粒种子的硬质外壳压碎后去除；然后使用手术刀和镊子在超净工作台上撕开核仁的外皮，同时只刮取>50mg的种子子叶部分样品置于离心管内，每份子叶样品均单独存放。5.根据权利要求4所述的高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，其特征在于，步骤C具体为：C1、在每份装有子叶样品的离心管内加入一粒钢珠，用液氮浸泡后充分研磨；然后，直接加入CTAB提取液后混匀，金属浴后加入等体积抽提混合液，震荡混匀；C2、离心，吸取上层水相于干净离心管中，加入等体积抽提混合液后震荡混匀，离心，再次吸取上层水相于干净离心管中；然后加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置，离心，去上清液，加入70％乙醇，震荡，离心，去上清液，吸取残留液体并晾干DNA沉淀，加入TE溶液溶解；C3、使用微量DNA纯化试剂盒纯化上述DNA粗提液；具体操作步骤如下：DNA粗提液加0.5倍体积的BufferP3和等体积无水乙醇，室温下充分混匀；混合液在离心条件下通过DNA吸附柱；弃去过滤液，将吸附柱放回原管，加入SPW后离心，弃过滤液后再次加入SPW清洗吸附柱；将吸附柱放回原管，离心以彻底去除各种残留液体；最后将吸附柱套入离心管中加入ddH2O，离心洗脱吸附柱中DNA，重复洗脱1次；取2～5μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，置于-80℃冰箱保存备用，亲本直接采集少许嫩叶同步进行研磨及DNA提取。...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦云，柴春燕，舒巧云，
申请(专利权)人：宁波市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33