一种先天性缺牙易感基因的检测方法技术

一种先天性缺牙易感基因检测芯片及检测方法。本发明专利技术的成果不仅将显著提高先天性缺牙遗传学诊断的效率，扩大其候选基因的诊断涵盖面，同时将极大地丰富先天性缺牙的致病突变谱，利于分析基因间的交互作用，使我们对于这种疾病的致病因素有更加深入的认识。这些极富价值的研究成果最终将有利于先天性缺牙的遗传咨询和产前诊断。

A Method for Detecting Susceptibility Genes of Congenital Dental Deficiency

The invention relates to a gene chip for detecting susceptibility to congenital tooth absence and a detection method thereof. The results of the present invention will not only significantly improve the efficiency of genetic diagnosis of congenital tooth absence, expand the diagnostic coverage of candidate genes, but also greatly enrich the mutation spectrum of congenital tooth absence, facilitate the analysis of gene interactions, and enable us to have a deeper understanding of the pathogenic factors of this disease. These valuable research results will eventually be conducive to genetic counseling and prenatal diagnosis of congenital missing teeth.

【技术实现步骤摘要】
一种先天性缺牙易感基因的检测方法
本专利技术涉及基因芯片，具体的说是一种先天性缺牙易感基因的检测方法。
技术介绍
由于牙胚发育异常造成的先天性牙齿数量减少称为先天性缺牙。近年来，随着在牙齿发育中各种分子，如转移因子、生长因子、受体分子、细胞表面分子、细胞间分子等的定位，及对其在牙齿发育期间调节作用的研究，使对先天性缺牙遗传因素的研究更加深入，但各学者的看法不一致。例如，Vastardis等研究发现MXS1基因位点突变时，小鼠可表现为严重地多数缺牙；人类则表现为第二前磨牙和第三磨牙先天性缺失。此外，还有学者研究发现上皮生长因子(Epideralgrowthfactor,EGF)、上皮生长因子受体(Epideralgrowthfactorreceptor，EGFR)、成纤维细胞生长因子(Fibroblastgrowthfactor，FGF)在牙齿发育期有重要的作用。因而学者们提出EGF、EGFR、FGF等因子基因位点突变可引起先天性缺牙。而Arte等采用连锁分析法，对7个患有先天性少数牙缺失的芬兰家庭三代人做家系调查，并采取患者外周血，用PCR技术分析其指纹图谱，却排除了EGF、EGFR、FGF-3因子的基因位点是先天性个别缺牙基因突变的位点。Nieminen等在研究切牙-前磨牙先天缺失的患者的基因时却未发现MXS1基因位点异常。本申请人收集了国内外关于先天性缺牙易感基因的文献和报道，并对文献和报道进行整理，发现了与先天性缺牙相关的基因有大概60个，尚未发现对这些基因进行整体研究的技术或文献，对这些基因进行筛选和功能确认，如果对这些基因进行整体研究，需要对基因进行检测。目前针对先天缺牙致病基因的检测手段主要包括Sanger测序、外显子测序及全基因组测序。而Sanger测序耗时、耗材且耗费人力；外显子测序及全基因组测序不仅价格昂贵且测序结果数据量庞大、周期长和成本高。Sanger测序、外显子测序及全基因组测序若用于先天性缺牙相关的基因整体研究，则会耗费大量的资源，因此需要一种更加高效的方法减低先天性缺牙致病基因筛选成本并提高筛选效率。
技术实现思路
本专利技术提供一种先天性缺牙易感基因的检测方法，该方法能快速检测先天缺牙致病基因，减低致病基因筛选成本并提高筛选效率。一种先天性缺牙易感基因的检测方法，所述方法包括：(1)对待测序DNA样品进行PCR扩增，制备测序文库片段；扩增待测序DNA样品的引物序列设计模板来自35个先天性缺牙相关基因：EDA、EDAR、EDARADD、WNT10A、MSX1、PAX9、AXIN2、BMP4、LTBP3、PITX2、SMOC2、PTH1R、GRHL2、GREM2、TRAF6、LHX8、LRP6、Lef1、SP3、BCOR、SLC26A2、Barx1、FGFR2、GJA1、NFKBIA、IKBKG、IRF6、OFD1、TP63、PVRL1、TBX3、TFAP2B、TCOF1、MSX2和SHH；所述待测序DNA样品提取自人类体液；(2)将测序文库片段通过PCR扩增过程克隆到离子微球颗粒上；(3)将PCR扩增后的离子微球颗粒注入到测序芯片上，加入运行测序程序；(4)结果分析。所述步骤(1)中PCR扩增方法为：(1a)对待测序DNA样品用自制引物进行PCR扩增，得初步测序文库片段；(1b)将初步测序文库片段进行消化引物、接头序列连接步骤后，用商业引物进行初步测序文库片段的PCR扩增，制备测序文库片段。所述步骤(1a)中扩增待测序DNA样品的自制引物序列的核酸序列为SEQNO.1-934。所述步骤(1)中扩增待测序DNA样品的自制引物分散到引物库1和引物库2，所述自制引物库1种包含的引物序列为SEQNO.1-474，所述自制引物库2包含的引物序列为SEQNO.475-934。所述步骤(1a)的PCR扩增程序为酶活化后，99℃变性15秒、60℃退火/延伸17个循环4min，最后10℃静置。所述自制引物库1包括237个扩增子，所述自制引物库2包括扩增子230个；所述扩增子的平均长度为125-375bp。所述步骤(1b)中所述的PCR扩增程序为98℃静置2min，98℃15秒/64℃1min循环5次，最后10℃静置。所述步骤(2)中的PCR扩增为乳浊液PCR扩增。本专利技术所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，可以一次性检测35个基因的序列，在步骤(1)中就涉及到467对PCR扩增引物。在PCR扩增DNA片段时，需根据引物的Tm值设置PCR条件，如延长温度等，而由于本专利技术使用引物数量较多，众多引物的Tm值和理化性质差异比较大，为了让PCR扩增顺利进行，我们在数据系统进行了多次优化模拟，最后确定将自制引物分为2个引物库，并且最终实验数据证明2个引物库的设置能够满足文库构建的需求。本专利技术旨在将半导体芯片技术与扩增子测序这种最新的测序技术相结合，建立一种能同时对目前已经确定的十余种先天性缺牙候选基因的外显子及外显子-内含子结合区域进行大样本量检测的；方便、快捷、高效的；可应用于先天性缺牙遗传学诊断的新方法。本专利技术的成果不仅将显著提高先天性缺牙遗传学诊断的效率，扩大其候选基因的诊断涵盖面，同时将极大地丰富先天性缺牙的致病突变谱，利于分析基因间的交互作用，使我们对于这种疾病的致病因素有更加深入的认识。这些极富价值的研究成果最终将有利于先天性缺牙的遗传咨询和产前诊断。附图说明图1为待测序DNA样品AFK139-149用引物库1制备的测序文库片段用Agilent2100BioanalyzerTMinstrument分析的结果图。图2为待测序DNA样品AFK112用引物库2制备的测序文库片段用Agilent2100BioanalyzerTMinstrument分析的结果图。图3为测序单元1(待测序DNA样品AFK105-AFK125)的SummaryReport对应的图。实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1待测序DNA样品的获取1)收集患者、家系成员以及正常对照的唾液样本2mL，收集于Oragene·DNA(OG-500)DNA采集试剂盒(DNAGenoteck，毕匹生物科技有限公司总代理)中的唾液样本采集管内，室温下储存。2)使用Oragene·DNA(OG-500)DNA采集试剂盒(DNAGenoteck，毕匹生物科技有限公司总代理)对采集到的唾液样本进行人基因组DNA的提取。3)提取的DNA取1μl上样，1％琼脂糖凝胶电泳检验基因组DNA量，UV-640Beckman分光光度计进行DNA定量。以适量体积分装，-20℃冻存。实施例2先天性缺牙基因的筛选收集已经被报道的可能与先天性缺牙相关的基因，根据基因在牙胚发育过程中表达的重要性、在各文献或报道等出现频次、数据资料等因素，从收集的60多个先天性缺牙候选基因中筛选出35个，并且按照是否曾在人类先天性缺牙患者中检测出突变进行分类，如表1所示：表1：入选的先天性缺牙基因本专利技术所述的先天性缺牙易感基因的检测方法使用的检测样本来自患者、家系成员以及正常对照，可以检测出先天性缺牙患者在表1中35个基因序列中发生的基因突变情况，一方面用临床大数据验证现有的研发成果，另一方面也可以探索这35个基因在先天性缺牙患者基因中的连锁情况，从基因层面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述方法包括：步骤(1)对待测序DNA样品进行PCR扩增，制备测序文库片段；扩增待测序DNA样品的引物序列设计模板来自35个先天性缺牙相关基因：EDA、EDAR、EDARADD、WNT10A、MSX1、PAX9、AXIN2、BMP4、LTBP3、PITX2、SMOC2、PTH1R、GRHL2、GREM2、TRAF6、LHX8、LRP6、Lef1、SP3、BCOR、SLC26A2、Barx1、FGFR2、GJA1、NFKBIA、IKBKG、IRF6、OFD1、TP63、PVRL1、TBX3、TFAP2B、TCOF1、MSX2和SHH；所述待测序DNA样品提取自人类体液；步骤(2)将测序文库片段通过PCR扩增过程克隆到离子微球颗粒上；步骤(3)将PCR扩增后的离子微球颗粒注入到测序芯片上，加入运行测序程序；步骤(4)结果分析。

【技术特征摘要】
1.一种先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述方法包括：步骤(1)对待测序DNA样品进行PCR扩增，制备测序文库片段；扩增待测序DNA样品的引物序列设计模板来自35个先天性缺牙相关基因：EDA、EDAR、EDARADD、WNT10A、MSX1、PAX9、AXIN2、BMP4、LTBP3、PITX2、SMOC2、PTH1R、GRHL2、GREM2、TRAF6、LHX8、LRP6、Lef1、SP3、BCOR、SLC26A2、Barx1、FGFR2、GJA1、NFKBIA、IKBKG、IRF6、OFD1、TP63、PVRL1、TBX3、TFAP2B、TCOF1、MSX2和SHH；所述待测序DNA样品提取自人类体液；步骤(2)将测序文库片段通过PCR扩增过程克隆到离子微球颗粒上；步骤(3)将PCR扩增后的离子微球颗粒注入到测序芯片上，加入运行测序程序；步骤(4)结果分析。2.如权利要求1所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述步骤(1)中PCR扩增方法为：(1a)对待测序DNA样品用自制引物进行PCR扩增，得初步测序文库片段；(1b)将初步测序文库片段进行消化引物、接头序列连接步骤后，用商业引物进行初步测序文库片段的PCR扩增，...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩冬，冯海兰，刘洋，刘浩辰，王升威，王越，刘湘，宋晓玲，
申请(专利权)人：北京大学口腔医学院，
类型：发明
国别省市：北京,11