小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选制造技术

本发明专利技术公开了一种小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，涉及抗病毒药物技术领域，其包括一种小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，其步骤如下：人胚肾细胞(293T)、人肺上皮细胞(A549)和HeLa细胞的培养。该小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，通过细胞的培养、假病毒的制备、小分子化合物的准备、抗EBOV假病毒活性筛选、初步作用机制研究、感染性EBOV实验以及对实验结果的分析形成了一个完整的筛选体系，且在筛选体系的各个环节中均涉及到了具体的实验步骤以及对实验结果的对比印证，结果可信度高，同时各个环节中还描绘出了相关的操作步骤，进而体现出来了本筛选方式和方法的科学性。

Screening of Anti-ebola Virus Activity of Small Molecular Compound 1712

The invention discloses an activity screening of a small molecule synthetic compound 1712 against Ebola virus, which relates to the technical field of antiviral drugs. It includes the activity screening of a small molecule synthetic compound 1712 against Ebola virus. The steps are as follows: culture of human embryonic kidney cells (293T), human lung epithelial cells (A549) and HeLa cells. The activity screening of the small molecule synthetic compound 1712 against Ebola virus has formed a complete screening system through cell culture, preparation of pseudovirus, preparation of small molecule compounds, screening of anti-EBOV pseudovirus activity, preliminary mechanism research, infectious EBOV experiment and analysis of the experimental results. The specific facts are involved in every link of the screening system. The experimental steps and the comparison of the experimental results prove that the results are credible. At the same time, the relevant operational steps are depicted in each link, which reflects the scientificity of the screening method and method.

【技术实现步骤摘要】
小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选
本专利技术涉及抗病毒药物
，具体为一种小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选。
技术介绍
艾博拉病毒，通过体液传播，粘液、唾液或血液都是媒介，甚至握一握手就会传染，艾博拉是一种致命的流血热传染病，会感染包括人类、猴子及黑猩猩在内的灵长类动物，人类患者半数以上在两星期内七孔流血而死。目前已有很多关于EBOV复制感染不同周期的小分子化合物研究的文献报道，其分子类型多种多样，如抑制EBOV复制感染前期的化合物LJ001，组织蛋白酶CatB/L抑制剂，均属于酰胺类衍生化合物，Shah等2010年报道，使用一种叫四氢喹啉氧化氨甲酸酯的化合物，能选择性地抑制组织蛋白酶CatL，从而阻止EBOV感染，现有的多数文献中所用质粒分别为：流感HA、NA，来源于A/Goose/Qinghai/59/05(H5N1)[Guo13etal.，2009a]及LASVGP[Radoshitzkyetal.，2007]；EbolaZaire—GP及HIV核质粒(pNL4-3.Luc.R-E-)[Heetal.，1995]，虽然文献报告中提到了很多重要的资料信息，但是关于文献报告的权威性，仍需要通过严格的实验来进行印证，但关于小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选方式以及使用方法并没有具体的报道显示，因此亟需一种小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选来解决上述问题。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，解决了关于文献报告的权威性，仍需要通过严格的实验来进行印证，但关于小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选方式以及使用方法并没有具体报道显示的问题。(二)技术方案为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，其步骤如下：S1：人胚肾细胞(293T)、人肺上皮细胞(A549)和HeLa细胞的培养；S2：埃博拉EBOV、流感H5N1和拉沙LASV三种假病毒的制备；S3：配置母液；S4：对抗EBOV假病毒的活性进行筛选；S5：测定HIV/EBOV病毒信号，进行初步作用机制研究，并得出加时实验结果；S6：进行EBOV毒株感染性实验，以及感染性EBOV的实验结果；S7：小分子化合物1712抗ebola病毒的活性筛选结果。优选的，所述人胚肾细胞(293T)、人肺上皮细胞(A549)和HeLa细胞在进行培养时，需选取三个辅以10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM(Gibco)，在所述三个DMEM(Gibco)中分别注入人胚肾细胞(293T)、人肺上皮细胞(A549)和HeLa细胞，后向三个DMEM(Gibco)中加入100μg/ml链霉素和青霉素(Invitrogen)用以防止细菌感染。优选的，所述埃博拉EBOV、流感H5N1和拉沙LASV三种假病毒在进行制备时，需分别将HIV/EBOV质粒、HIV/H5N1质粒和HIV/LASV质粒通过PEI转染方案瞬时转染到铺板率为50-70％的293T细胞中，转染6h后，用PBS洗涤细胞，并将培养皿(150mm)中原培养基更换为20ml新鲜无色培养基，转染24h后，收集上清液，通过0.45μm微孔滤膜(NalgEN)进行过滤，最后将三种病毒储存在4℃环境下以留备用。优选的，所述母液在进行制备时，先查阅文献，后由小分子库中随机选取三大类母核各100种具有抗炎抑菌抗疟等活性的小分子化合物，且三大类母核结构分别为喹啉类生物碱、联苯类化合物和吩噻嗪类化合物，后对三大类母核通过DMSO进行溶解，配置成10mM的母液，最后储存在4℃环境下以留备用，同时根据抗病毒活性筛选标准(平均抑制率≥80％，细胞存活率≥70％)进行比较得出，联苯类化合物、吩噻嗪类化合物活性较差，相较之下，喹啉类生物碱显现出较好的抗EBOV活性。优选的，所述抗EBOV假病毒活性进行筛选时，先将A549细胞接种于384孔板中(1000/孔)，且需在4℃条件下进行培养，后用含有荧光素酶报告基因HIV/EBOV、HIV/H5N1及HIV/LASV假病毒颗粒分别感染细胞，同时加入待测化合物，使其终浓度达到10uM，0.0625％DMSO(V/V)，并在CO2箱中孵育48小时后，用Neolite报告基因检测系统(PerkinElmer)对感染后细胞中的荧光素酶活性进行定量，阴性对照为0.0625％DMSO液，阳性对照为HIV反转录酶抑制剂AZT(5μM)，每孔重复两次，对数据进行归一化处理，挑选对HIV/EBOV特异性效果且平均抑制率≥80％的化合物，重复该实验，进行验证，以确认初步结果，同时还需用CellTiter-发光细胞活力测定(Promega，Madison，WI，USA)，在A549细胞中，采用与抗病毒筛选相同的方法检测化合物的细胞毒性，对数据进行归一化处理，挑选细胞存活率≥70％的化合物，采用二倍稀释法，分别进行CC50/IC50测定，采用GraphPadPrism软件(7.04版)对结果进行数据处理。优选的，所述HIV/EBOV病毒信号进行测定时，需通过加时实验考察化合物对其初步作用机制，在4℃条件下，且已孵育12h后的A549细胞(96孔板，10000/孔)，应先弃培养液，并用HIV/EBOV病毒液孵育1小时，使病毒完全附着于细胞表面但尚未入侵细胞，倾倒病毒液，后用PBS洗涤两次，加入新鲜的无色DMEM，37℃条件下置于CO2培养箱内进行孵育，并在不同的时间点，分别加入细胞存活率≥70％的化合物，使其在培养基中的浓度为10μM，以此评价待选药物进入病毒的时间节点，借此判断其初步作用机制，且每孔重复三次，并以苯托品(25μM)作为对照，感染后48小时再次进行测定HIV/EBOV病毒信号，可重复以上测定操作步骤，最后得出加时实验结果，SYL1712与已有文献报道的EBOV-GP介导中的融合抑制剂苯托品进行对照发现，两者在病毒入侵1小时之内加入，均有明显的抑制作用，病毒入侵1h后再加入对照品，对照品的抑制效果已经明显降低，相较之下，我们的化合物SYL1712在病毒入侵2h之内加入，均有明显的抑制病毒效果，但随着时间的增加，也迅速丧失其抗病毒效果，表明其抗病毒机制可能在抑制病毒入侵的整个环节均能起到很好的作用。优选的，所述EBOV毒株在进行感染性实验时，选用HeinzFeldmann馈赠的EBOV毒株在美国德克萨斯生物医学研究所(TexasBiomedicalResearchInstitute)BSL-4实验室进行，且所述EBOV毒株内两个核蛋白NP和VP35之间插入了绿色荧光蛋白(GFP)，实验过程中先将病毒在Vero细胞中扩增，取上清液后，通过20％蔗糖缓冲液在4℃条件下离心2小时，取沉淀，重新悬浮于PBS中，-80℃备用，实验采用384孔板，Vero细胞铺板(4000/孔)，过夜后，用EBOV-GFP病毒(MOI：0.05-0.15)进行细胞感染，同时加入不同浓度的化合物(10nM的Bafilomycin作为阳性对照)，重复两次实验，经CO2培养箱孵育24小时后，取出，在4℃条件下，用福尔马林液浸泡细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，其步骤如下：S1：人胚肾细胞(293T)、人肺上皮细胞(A549)和HeLa细胞的培养；S2：埃博拉EBOV、流感H5N1和拉沙LASV三种假毒病的制备；S3：配置母液；S4：对抗EBOV假病毒的活性进行筛选；S5：测定HIV/EBOV病毒信号，进行初步作用机制研究，并得出加时实验结果；S6：进行EBOV毒株感染性实验，以及感染性EBOV的实验结果；S7：小分子化合物1712抗ebola病毒的活性筛选结果。

【技术特征摘要】
1.一种小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，其步骤如下：S1：人胚肾细胞(293T)、人肺上皮细胞(A549)和HeLa细胞的培养；S2：埃博拉EBOV、流感H5N1和拉沙LASV三种假毒病的制备；S3：配置母液；S4：对抗EBOV假病毒的活性进行筛选；S5：测定HIV/EBOV病毒信号，进行初步作用机制研究，并得出加时实验结果；S6：进行EBOV毒株感染性实验，以及感染性EBOV的实验结果；S7：小分子化合物1712抗ebola病毒的活性筛选结果。2.根据权利要求1所述的小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，其特征在于：所述人胚肾细胞(293T)、人肺上皮细胞(A549)和HeLa细胞在进行培养时，需选取三个辅以10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM(Gibco)，在所述三个DMEM(Gibco)中分别注入人胚肾细胞(293T)、人肺上皮细胞(A549)和HeLa细胞，后向三个DMEM(Gibco)中加入100μg/ml链霉素和青霉素(Invitrogen)用以防止细菌感染。3.根据权利要求1所述的小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，其特征在于：所述埃博拉EBOV、流感H5N1和拉沙LASV三种假病毒在进行制备时，需分别将HIV/EBOV质粒、HIV/H5N1质粒和HIV/LASV质粒通过PEI转染方案瞬时转染到铺板率为50-70％的293T细胞中，转染6h后，用PBS洗涤细胞，并将培养皿(150mm)中原培养基更换为20ml新鲜无色培养基，转染24h后，收集上清液，通过0.45μm微孔滤膜(NalgEN)进行过滤，最后将三种病毒储存在4℃环境下以留备用。4.根据权利要求1所述的小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，其特征在于：所述母液在进行制备时，先查阅文献，后由小分子库中随机选取三大类母核各100种具有抗炎抑菌抗疟等活性的小分子化合物，且三大类母核结构分别为喹啉类生物碱、联苯类化合物和吩噻嗪类化合物，后对三大类母核通过DMSO进行溶解，配置成10mM的母液，最后储存在4℃环境下以留备用，同时根据抗病毒活性筛选标准(平均抑制率≥80％，细胞存活率≥70％)进行比较得出，联苯类化合物、吩噻嗪类化合物活性较差，相较之下，喹啉类生物碱显现出较好的抗EBOV活性。5.根据权利要求1所述的小分子合成化合物1712抗ebola病毒的活性筛选，其特征在于：所述抗EBOV假病毒活性进行筛选时，先将A549细胞接种于384孔板中(1000/孔)，且需在4℃条件下进行培养，后用含有荧光素酶报告基因HIV/EBOV、HIV/H5N1及HIV/LASV假病毒颗粒分别感染细胞，同时加入待测化合物，使其终浓度达到10uM，0.0625％DMSO(V/V)，并在CO2箱中孵育48小时后，用Neolite报告基因检测系统(PerkinElmer)对感染后细胞中的荧光素酶活性进行定量，阴性对照为0.0625％DMSO液，阳性对照为HIV反转录酶抑制剂AZT(5μM)，每孔重复两次，对数据进行归一化处理，挑选对HIV/EBOV特异性效果且平均抑制率≥80％的化合物，重复该实验，进行验证，以确认初步结果，同时还需用CellTiter-发光细胞活力测定(Promega，Madison，WI，USA)，在A549细胞中，采用与抗病毒筛选相同的方法检测化合物的细胞毒性，对数据进行归一化处理，挑选细胞存活率≥70％的化合物，采用二倍稀释法，分别进行CC50/IC50测定，采用GraphPadPrism软件(7.04版)对结果进行数...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔清华，荣立军，杜瑞坤，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：山东,37