3-甲基巴豆酸脱羧酶(MDC)变体制造技术

本文描述了3‑甲基巴豆酸脱羧酶(MDC)变体，其在将3‑甲基巴豆酸转化为异丁烯方面显示出改进的活性；以及使用这种酶变体产生异丁烯的方法。

3-methyl crotonate decarboxylase (MDC) variant

This paper describes a variant of 3 methyl crotonic acid decarboxylase (MDC), which shows improved activity in converting 3 methyl crotonic acid to isobutene, and the method of producing isobutene by using this variant.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】3-甲基巴豆酸脱羧酶(MDC)变体本文描述了在将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯方面显示改进活性的3-甲基巴豆酸脱羧酶(MDC)变体，以及使用这样的酶变体生产异丁烯的方法。目前许多化学化合物源自石油化学品。烯类(如乙烯、丙烯、不同的丁烯或例如其他戊烯)在例如用于产生聚丙烯或聚乙烯的塑料工业、化学工业其他领域和燃料领域中使用。丁烯以四种形式存在，其中之一，异丁烯(isobutene，也称为异丁烯(isobutylene))，进入甲基叔丁基醚(MTBE)(汽车燃料用抗爆添加剂)组合物中。异丁烯也可以用来产生异辛烯(isooctene)，而异辛烯转可以被还原成异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高辛烷值使其成为所谓“汽油”发动机的最佳燃料。烯类如异丁烯目前通过催化性裂解石油产物(或在己烯的情况下从煤炭或天然气中通过Fischer-Tropsch法的衍生物)产生。生产成本因此与油价紧密相关。另外，催化性裂解时常伴随着相当大的技术难题，这增加了工艺复杂性和生产成本。在与地球化学循环和谐相处的可持续工业运营背景下，需要通过生物途径生产烯类如异丁烯。由于发酵和蒸馏过程已经在食品加工产业中存在，第一代生物燃料由乙醇的发酵生产组成。第二代生物燃料的生产处于探索期，其尤其包括生产长链醇(丁醇和戊醇)、萜烯、链烷烃和脂肪酸。两份最新综述提供了这个领域中研究的总体概述：Ladygina等(ProcessBiochemistry41(2006),1001)和Wackett(CurrentOpinionsinChemicalBiology21(2008),187)。先前已经描述了用于酶促产生异丁烯的不同途径；参见，例如，Fujii等(Appl.Environ.Microbiol.54(1988),583)；Gogerty等(Appl.Environm.Microbiol.76(2010),8004-8010)，vanLeeuwen等(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012),1377-1387)和WO2010/001078。除了这些途径之外，还存在提供异丁烯的替代途径，其利用通过脱羧反应将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯。脱羧是一种化学反应，可以去除羧基并释放二氧化碳(CO2)。US-A1-2009/0092975中已经提出了3-甲基巴豆酸的脱羧，但没有关于该转化的实验证据。在US-A1-2009/0092975中，描述了来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的称为PAD1的核酸序列，并且公开其编码脱羧酶。该酶被认为可用作重组生物中的选择性标记，而它被描述为可使用“弱酸”作为选择剂。3-甲基巴豆酸等许多其他酸被称为潜在的“弱酸。”然而，后来才发现上述PAD1实际上不提供脱羧酶活性。事实上，细菌ubiD和ubiX或同源真核生物fdc1和pad1基因已经涉及非氧化性可逆脱羧。苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)和阿魏酸脱羧酶(FDC)的联合作用被认为对于酿酒酵母中苯基丙烯酸的脱羧是必需的(J.Biosci.Bioeng.109,(2010),564-569；AMBExpress,5:12(2015)1-5；ACSChem.Biol.10(2015),1137-1144)。最近，被描述为苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)的上述酶家族被表征为FMN异戊烯基转移酶并且不再是脱羧酶。已经表明，Fdc1(但不是PAD)完全负责可逆的脱羧酶活性，并且它需要新型辅因子，即由相关的UbiX(或Pad1)蛋白合成的异戊烯化黄素(prenylatedflavin)。因此，该PAD酶的真正酶活性已被鉴定为具有异戊二烯部分(来自二甲基烯丙基磷酸或焦磷酸，称为DMAP或DMAPP)的黄素单核苷酸(FMN)辅因子的转化。该反应如图1A所示。因此，与现有技术的观点相反，真正的脱羧酶是与修饰的FMN(异戊二烯化的FMN)结合的阿魏酸脱羧酶(FDC)。该反应如图1B所示。最近描述了阿魏酸脱羧酶(FDC)与修饰的FMN(异戊二烯化-FMN)(后者由PAD酶提供)相关的这种机制，并涉及令人惊讶的酶促机制，即通过1,3-偶极环加成进行α，β-不饱和酸脱羧。此外，最近阐明了该FDC脱羧酶的结构(Nature522(2015)，497-501；Nature，522(2015)，502-505；Appl.Environ.Microbiol.81(2015)，4216-4223)。尽管上述手段和方法允许由2-甲基巴豆酸生产异丁烯，但仍需要改进，特别是关于进一步提高该方法的效率以使其更适合于工业目的的改进。本申请通过提供权利要求中限定的实施方案来满足这种需要。在第一方面，本专利技术提供了3-甲基巴豆酸脱羧酶(MDC)的变体，其相对于其所源自的相应MDC，显示在将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯方面改进的活性。改进的酶变体或能够以增加的活性催化反应的酶变体被定义为以下的酶变体，其不同于野生型酶并且催化3-甲基巴豆酸转化为异丁烯，从而就至少一种给定浓度的3-甲基巴豆酸(优选大于0M至1M的任何3-甲基巴豆酸)而言，酶变体的比活高于野生型酶的比活。比活定义为转化成产物摩尔的底物摩尔数除以单位时间除以酶摩尔数。Kcat(转换数)是底物饱和浓度下的比活。特别地，根据该第一方面，本专利技术提供能够以至少1×10-3s-1的3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化率，将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶。可以通过在3-甲基巴豆酸脱羧酶(MDC)中的特定位置进行突变来提供这样的酶，并且通过进行这种突变获得的变体在催化3-甲基巴豆酸转化为异丁烯方面显示出改进的活性。在优选的实施方案中，该酶能够以至少2×10-3s-1的3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化率，将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯，在特别优选的实施方案中转化率为至少4×10-3s-1。在最优选的实施方案中，酶具有至少10×10-3s-1或至少1s-1，或至少10s-1，甚至更优选至少100s-1的3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的转换率。相应的野生型酶具有约1×10-3s-1的3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的转换率。在本专利技术的上下文中，“改进的活性”是指所讨论的酶的活性至少10％，优选至少20％，更优选至少30％或50％，甚至更优选至少70％或80％，特别优选至少90％或100％高于变体所源自的酶，优选高于SEQIDNO：1所示的酶。在甚至更优选的实施方案中，改进的活性可以比变体所源自的相应酶(优选比SEQIDNO：1所示的酶)的活性高至少150％、至少200％、至少300％、至少750％或至少1000％。在特别优选的实施方案中，如下所述，通过使用纯化的酶和化学合成的底物的测定来测量活性。与亲本酶相比，变体的改进活性可以在给定条件下在给定时间内测量为更多的异丁烯产生。这种改进的活性可以由更高的转换数量产生，例如更高的kcat值。也可以由较低的Km值产生。也可以由更高的kcat/Km值产生。最后，它可以由更高的溶解度或酶的稳定性产生。改进程度可以作为异丁烯生产的改进来测量。就可溶性蛋白质产生或蛋白质稳定性而言，还可以根据kcat改进、kcat/Km改进或Km降低来测量改进程度。在另一个实施方案中，本专利技术提供的酶变体能够将3-甲基巴豆酸转化为异丁本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.3‑甲基巴豆酸脱羧酶(MDC)的变体，其相对于所源自的对应MD C，在将3‑甲基巴豆酸转化为异丁烯方面显示改进的活性，并具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：1具有至少73％序列同一性的氨基酸序列，其中在选自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的405、2、12、13、29、31、33、35、89、114、195、197、221、293、337、351、376、381、388、420、422、435、436、439、441、447、449、500、506和511位置上，或在这些位置中任意个对应的位置上的一个或多个氨基酸残基被另一氨基酸残基取代或缺失，或者已在这些位置中的一个或多个处进行了插入。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.04 EP 16168448.5;2016.11.18 EP 16199502.21.3-甲基巴豆酸脱羧酶(MDC)的变体，其相对于所源自的对应MDC，在将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯方面显示改进的活性，并具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列，或具有与SEQIDNO：1具有至少73％序列同一性的氨基酸序列，其中在选自SEQIDNO：1所示氨基酸序列中的405、2、12、13、29、31、33、35、89、114、195、197、221、293、337、351、376、381、388、420、422、435、436、439、441、447、449、500、506和511位置上，或在这些位置中任意个对应的位置上的一个或多个氨基酸残基被另一氨基酸残基取代或缺失，或者已在这些位置中的一个或多个处进行了插入。2.权利要求的MDC变体，其中(1)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第2位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或缬氨酸取代；和/或(2)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第12位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丝氨酸、丙氨酸或天冬酰胺取代；和/或(3)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第13位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被组氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、缬氨酸或酪氨酸取代；和/或(4)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第29位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被天冬酰胺、组氨酸或丝氨酸取代；和/或(5)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第31位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被谷氨酸或甘氨酸取代；和/或(6)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第33位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被异亮氨酸取代；和/或(7)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第35位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代；和/或(8)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第89位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丝氨酸或苯丙氨酸取代；和/或(9)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第114位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丝氨酸取代；和/或(10)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第195位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸取代；和/或(11)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第197位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被苯丙氨酸或甲硫氨酸取代；和/或(12)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第221位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被半胱氨酸取代；和/或(13)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第293位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被亮氨酸取代；和/或(14)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第337位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被甲硫氨酸或亮氨酸取代；和/或(15)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第351位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被精氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸取代；和/或(16)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第376位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被异亮氨酸取代；和/或(17)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第381位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被精氨酸取代；和/或(18)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第388位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被谷氨酸取代；和/或(19)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第405位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或谷氨酰胺取代；和/或(20)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第420位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被亮氨酸取代；和/或(21)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第422位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被甲硫氨酸取代；和/或(22)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第435位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被甲硫氨酸取代；和/或(23)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第436位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被天冬酰胺取代；和/或(24)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第439位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被亮氨酸取代；和/或(25)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第441位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被酪氨酸取代；和/或(26)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第447位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被色氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸取代；和/或(27)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第449位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被异亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸取代；和/或(28)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第500位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丙氨酸取代；和/或(29)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第506位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被异亮氨酸或酪氨酸取代；和/或(30)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第511位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被甲硫氨酸或异亮氨酸取代。3.权利要求1或2的MDC变体，其中所述变体还在SEQIDNO：1所示氨基酸序列中的3、4、5、6、7、8、9、10、11、14、15、25、30、34、40、43、57、60、65、67、69、70、71、72、80、84、85、86、87、90、91、99、101、102、103、105、106、108、111、117、119、120、126、132、141、146、149、154、159、160、162、175、176、187、189、193、206、211、213、214、215、216、222、228、232、244、247、264、278、284、285、303、305、306、326、338、341、342、345、349、352、375、377、384、386、392、395、399、402、404、406、414、429、440、442、443、445、448、454、460、461、462、484、488、493、494、496、501、502、509和512位置处显示至少一个修饰。4.权利要求1-3中任一项的MDC变体，其中还在SEQIDNO：1所示氨基酸序列中的3、4、5、6、7、8、9、10、11、14、15、25、30、34、40、43、57、60、65、67、69、70、71、72、80、84、85、86、87、90、91、99、101、102、103、105、106、108、111、117、119、120、126、132、141、146、149、154、159、160、162、175、176、187、189、193、206、211、213、214、215、216、222、228、232、244、247、264、278、284、285、303、305、306、326、338、341、342、345、349、352、375、377、384、386、392、395、399、402、404、406、414、429、440、442、443、445、448、454、460、461、462、484、488、493、494、496、501、502、509和512位置处显示至少一个修饰的MDC变体是如下MDC变体，其中(1)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第3位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、脯氨酸、色氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或酪氨酸取代；和/或(2)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第4位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被谷氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、丝氨酸或天冬酰胺取代；和/或(3)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第5位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丝氨酸取代；和/或(4)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第6位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被脯氨酸取代；和/或(5)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第7位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被精氨酸取代；和/或(6)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第8位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被天冬酰胺取代；和/或(7)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第9位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被组氨酸、脯氨酸或酪氨酸取代；和/或(8)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第10位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸或亮氨酸取代；和/或(9)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第11位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被亮氨酸、酪氨酸或脯氨酸取代；和/或(10)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第14位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被天冬氨酸取代；和/或(11)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第15位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被苏氨酸取代；和/或(12)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第25位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被天冬酰胺、丝氨酸或色氨酸取代；和/或(13)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第30位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被甘氨酸、组氨酸或精氨酸取代；和/或(14)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第34位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丙氨酸或异亮氨酸取代；和/或(15)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第40位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被异亮氨酸或甲硫氨酸取代；和/或(16)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第43位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被精氨酸取代；和/或(17)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第57位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被天冬酰胺取代；和/或(18)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第60位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被缬氨酸取代；和/或(19)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第65位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被亮氨酸或色氨酸取代；和/或(20)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第67位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被精氨酸或缬氨酸取代；和/或(21)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第69位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被天冬酰胺取代；和/或(22)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第70位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被异亮氨酸或亮氨酸取代；和/或(23)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第71位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被甘氨酸取代；和/或(24)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第72位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被精氨酸取代；和/或(25)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第80位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被亮氨酸取代；和/或(26)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第84位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被半胱氨酸取代；和/或(27)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第85位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丙氨酸或苏氨酸取代；和/或(28)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第86位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被天冬酰胺或异亮氨酸取代；和/或(29)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第87位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或色氨酸取代；和/或(30)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第90位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被亮氨酸取代；和/或(31)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第91位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被亮氨酸取代；和/或(32)SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第99位氨基酸残基或对应于该位置的位置上的氨基酸残基缺失，或被天冬酰胺或脯氨酸取...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·斯特里彻尔，B·维利耶，
申请(专利权)人：环球生物能源公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR