结合细胞Pol Ⅱ C末端结构域（CTD）的病毒多肽片段及其用途制造技术

本发明专利技术涉及通过计算机鉴别降低或阻止来自正黏病毒科的病毒RNA依赖性RNA聚合酶或其变体与其配体(优选与细胞Pol II，更优选与CTD)结合的化合物的方法，以及产生鉴别的化合物的方法。本发明专利技术还涉及可通过所述方法鉴别和/或产生的化合物。本发明专利技术还涉及针对RNA依赖性RNA聚合酶与其配体(特别是与细胞Pol II，特别是与Pol II的CTD)的结合位点的抗体、以及编码所述抗体的核酸和包含所述核酸的载体。本发明专利技术涉及可根据所述方法制备的药物组合物，和/或包含所述化合物、所述抗体、所述核酸或所述载体的药物组合物。本发明专利技术还涉及所述化合物、所述抗体、所述核酸、所述载体或所述药物在治疗、改善、或预防由正黏病毒科的病毒感染引起的疾病状况中的用途。

Viral polypeptide fragments binding to Pol II C terminal domain (CTD) of cells and their applications

The present invention relates to a method for computer identification of compounds that reduce or prevent viral RNA-dependent RNA polymerase or its variants from the Orthomyxoviridae family from binding to its ligands (preferred to cell Pol II, preferred to CTD) and a method for producing the identified compounds. The invention also relates to compounds that can be identified and/or generated by the method. The invention also relates to antibodies targeting the binding sites of RNA-dependent RNA polymerase and its ligands (in particular Pol II with cells, especially with Pol II CTD), as well as nucleic acids encoding the antibodies and vectors containing the nucleic acids. The present invention relates to pharmaceutical compositions that can be prepared according to the method, and/or pharmaceutical compositions comprising the compound, the antibody, the nucleic acid or the carrier. The invention also relates to the use of the compound, the antibody, the nucleic acid, the carrier or the drug in the treatment, improvement or prevention of disease conditions caused by viral infections in orthomyxoviridae.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合细胞PolⅡC末端结构域（CTD）的病毒多肽片段及其用途
本专利技术涉及用于通过计算机鉴别降低或阻止来自正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的病毒RNA依赖性RNA聚合酶或其变体与其配体(优选与细胞聚合酶II(PolII)，更优选与PolIIC末端结构域(CTD))结合的化合物的方法，以及产生鉴别出的化合物的方法。本专利技术还涉及可通过所述方法鉴别和/或产生的化合物。本专利技术还涉及针对RNA依赖性RNA聚合酶与其配体(特别是细胞PolII，特别是PolII的CTD)的结合位点的抗体、以及编码所述抗体的核酸和包含该核酸的载体。本专利技术涉及可根据所述方法制备的药物组合物，和/或包含所述化合物、所述抗体、所述核酸或所述载体的药物组合物。本专利技术还涉及所述化合物、所述抗体、所述核酸、所述载体或所述药物在治疗、改善、或预防由正黏病毒科病毒的病毒感染引起的疾病状况中的用途。
技术介绍
流感是造成世界上大量发病率和死亡率的原因，并被许多人视为属于对人类最主要的病毒威胁。每年流感疫情在全球范围内肆虐并且偶然出现的新致病菌株引起具有巨大破坏力的流行病。目前控制流感病毒疫情的主要手段是疫苗接种。然而，迅速产生突变的流感病毒避开了疫苗接种的作用。鉴于产生新的流感疫苗需要大约6个月的事实，特别需要替代治疗手段，即抗病毒药物，以作为对抗迅速传播的流行病的第一道防线。开发抗病毒药物的一个很好的起点是必要的病毒蛋白质的结构数据。因此，流感病毒表面抗原神经氨酸酶的晶体结构测定(vonItzstein等人，1993，Nature363：418-423)直接导致了具有能阻止病毒从细胞中释放而非阻止病毒产生的抗病毒活性的神经氨酸酶抑制剂的开发。这些抑制剂及其衍生物随后发展成抗流感药物，扎那米韦(葛兰素)和奥司他韦(罗氏)，它们目前由许多国家储存以作为抵御可能的流行病的第一道防线。然而，这些药物仅减少临床疾病的持续时间。或者，其他抗流感化合物例如金刚烷胺和金刚乙胺靶向病毒膜中的离子通道蛋白，即M2蛋白，以干扰细胞内病毒的脱壳。然而，由于它们的副作用和抗性病毒突变体的快速发展，它们尚未被广泛使用(Magden等人，2005，Appl.Microbiol.Biotechnol.66：612-621)。此外，更多非特异性病毒药物例如利巴韦林已显示出对于治疗流感感染的作用(Eriksson等人，1977，Antimicrob.AgentsChemother.11：946-951)。然而，利巴韦林可能是由于严重的副作用(Furuta等人，2005，Antimicrob.AgentsChemother.49：981-986)，而仅在少数国家获得批准。显然，需要新的抗病毒化合物，优选针对不同靶标的抗病毒化合物。甲型、乙型、丙型流感病毒属和鲑传贫病毒属(Isavirus)以及索戈托病毒属(Thogotovirus)属于正黏病毒科，其与布尼亚病毒科(Bunyaviridae)一样为负链RNA病毒，布尼亚病毒科包括汉坦病毒属(Hantavirus)、内罗病毒属(Nairovirus)、正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)、白蛉病毒属(Phlebovirus)、和番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。它们的基因组是分段的并且含有核糖核蛋白颗粒，所述核糖核蛋白颗粒包括RNA依赖性RNA聚合酶，所述RNA依赖性RNA聚合酶执行：(i)单链病毒粒子RNA(vRNA)到病毒mRNA的初始复制，和(ii)vRNA复制。聚合酶复合物似乎是合适的抗病毒药物靶标，因为它对于病毒mRNA合成和病毒复制是必要的，并且含有若干可能与宿主细胞蛋白质中发现的功能活性位点显著不同的功能活性位点(Magden等人，同上)。因此，例如已经尝试通过类似于PB1内PA结合结构域的25个氨基酸的肽来干扰聚合酶亚基的组装(Ghanem等人，2007，J.Virol.81：7801-7804)。此外，已经尝试通过核苷类似物如2′-脱氧-2′-氟鸟嘌呤来干扰病毒转录(Tisdale等人，1995，Antimicrob.AgentsChemother.39：2454-2458)，并且已经显示，T-705(一种经置换的吡嗪化合物)可以作为流感病毒RNA聚合酶的特异性抑制剂(Furuta等人，同上)。此外，已经靶向聚合酶的内切核酸酶活性，并且已经鉴别出一系列4位置换的2，4-二氧代丁酸化合物作为流感病毒中该活性的选择性抑制剂(Tomassini等人，1994，Antimicrob.AgentsChemother.38：2827-2837)。另外，在真菌物种Delitschiaconfertaspora的提取物中鉴定出的flutimide(经置换的2，6-二酮哌嗪)显示出可抑制流感病毒的内切核酸酶活性(Tomassini等人，1996，Antimicrob.AgentsChemother.40：1189-1193)。聚合酶的PA亚基在功能上是最不充分表征的，其涉及帽结合和内切核酸酶活性、vRNA复制、和有争议的蛋白酶活性。PA(甲型流感中的716个残基)可通过胰蛋白酶在213位残基处分离。结合至PB1N末端肽的PA的C末端三分之二部分的晶体结构提供了对PA亚基的大部分和其中一个关键的亚基间相互作用的确切性质的首次结构见解(He等人，2008，Nature454：1123-1126；Obayashi等人，2008，Nature454：1127-1131)。通过PA氨基末端结构域中保守残基的系统突变已经鉴别出对于聚合酶复合物的蛋白质稳定性、启动子结合、帽结合和内切核酸酶活性至关重要的残基(Hara等人，2006，J.Virol.80：7789-7798)。随后显示，抢帽内切核酸酶(cap-snatchingendonuclease)构成PA的N末端部分(约1至200个残基)(Dias等人Nature2009，PMID：19194459，Yuan等人，NaturePMID：19194459)，这大大推动了靶向内切核酸酶的药物开发(例如Kowalinski等人，PLoSPathog.2012，PMID22876177)。最后在2014年，完整蝙蝠甲型流感病毒(Pflug等人，Nature2014)和人乙型流感病毒(Reich等人，2014Nature)的晶体结构显示出PA是如何整合至完整的异三聚体中，并如何在稳定PB1亚基方面发挥额外作用，以及如何与PB1一起结合vRNA启动子的5′端。病毒复制需要主动使细胞RNA聚合酶II(PolII)转录(Mahy等人，1972，PNAS69：1421-1424)并且已经表明FluPol与PolII的C末端结构域(CTD)的物理缔合(Engelhardt等人，2005，Journalofvirology79：5812-5818；Loucaides等人，2009，Virology394：154-163)。病毒和细胞转录的这种紧密偶联被认为能够实现“抢帽”，这是病毒聚合酶抢夺短帽状寡聚物的独特机制，该短帽状寡聚物来源于初始的PolII转录物用于引发转录(Plotch等人，1981，Cell23：847-858；Reich等人，2014，Nature516：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过计算机鉴别降低或阻止来自正黏病毒科的病毒RNA依赖性RNA聚合酶或其变体与其配体(特别是与细胞Pol II，特别是与CTD)结合的化合物的方法，其包括以下步骤(a)基于病毒RNA依赖性RNA聚合酶与其配体的结合位点的结构坐标构建计算机模型；(b)通过选自以下的方法来选择潜在的调节化合物：(iv)修饰结合位点内的共结晶配体，(v)基于共结晶配体与病毒RNA依赖性RNA聚合酶的结合位点的相互作用特征，和/或基于与共结晶配体的3D相似性，从小分子数据库中过滤并选择化合物，和(vi)基于共结晶配体与病毒RNA依赖性RNA聚合酶的结合位点的相互作用特征和/或基于与共结晶配体的3D相似性，重新进行所述化合物的配体设计；(c)采用计算手段在所述化合物和所述结合位点的计算机模型之间执行拟合程序操作，以便提供所述化合物在活性位点的能量最小化构型；和/或采用计算对接方法将所述化合物定位并置于所述结合位点中，以便提供化学实体的合理3D排列，即所述化合物的合理3D排列；和(d)评估所述拟合操作的结果并任选地评估所述对接方法的结果，以量化所述化合物与结合位点模型之间的缔合，从而评估所述化合物与所述结合位点缔合的能力。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.07 EP 16178396.41.一种通过计算机鉴别降低或阻止来自正黏病毒科的病毒RNA依赖性RNA聚合酶或其变体与其配体(特别是与细胞PolII，特别是与CTD)结合的化合物的方法，其包括以下步骤(a)基于病毒RNA依赖性RNA聚合酶与其配体的结合位点的结构坐标构建计算机模型；(b)通过选自以下的方法来选择潜在的调节化合物：(iv)修饰结合位点内的共结晶配体，(v)基于共结晶配体与病毒RNA依赖性RNA聚合酶的结合位点的相互作用特征，和/或基于与共结晶配体的3D相似性，从小分子数据库中过滤并选择化合物，和(vi)基于共结晶配体与病毒RNA依赖性RNA聚合酶的结合位点的相互作用特征和/或基于与共结晶配体的3D相似性，重新进行所述化合物的配体设计；(c)采用计算手段在所述化合物和所述结合位点的计算机模型之间执行拟合程序操作，以便提供所述化合物在活性位点的能量最小化构型；和/或采用计算对接方法将所述化合物定位并置于所述结合位点中，以便提供化学实体的合理3D排列，即所述化合物的合理3D排列；和(d)评估所述拟合操作的结果并任选地评估所述对接方法的结果，以量化所述化合物与结合位点模型之间的缔合，从而评估所述化合物与所述结合位点缔合的能力。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合位点包括甲型流感病毒的RNA依赖性RNA聚合酶PA亚基(SEQIDNO：1)的氨基酸K630、R633、和E444；包括SEQIDNO：44的氨基酸K635、R638、和E449；或包括乙型流感病毒的RNA依赖性RNA聚合酶PA亚基(SEQIDNO：2)的氨基酸E445、K631、和R634，或包括占据与其比对的PA亚基序列中类似位置的的氨基酸。3.根据权利要求2所述的方法，其中甲型流感病毒的RNA依赖性RNA聚合酶PA亚基的结合位点还包括SEQIDNO：1的氨基酸K289、R449、和E452，任选还包括氨基酸F440和F607，并且任选地还包括一个或多于一个选自SEQIDNO：1的M288、L290、S291、T313、F314、I545、M543、和K554的氨基酸，任选地还包括SEQIDNO：1的氨基酸G629，或其中甲型流感病毒的RNA依赖性RNA聚合酶PA亚基的结合位点还包括SEQIDNO：44的氨基酸K289、R454、和E457，任选地还包括氨基酸Y44和F612，和任选地还包括一个或多于一个选自SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬·丘萨克，亚历山大·普夫卢格，玛利亚·卢卡尔斯卡，
申请(专利权)人：欧洲分子生物学实验室，
类型：发明
国别省市：德国,DE