polX家族的DNA聚合酶的变体制造技术

本发明专利技术涉及能够在没有模板链的情况下合成核酸分子的polX家族的DNA聚合酶的变体或该聚合酶的功能片段的变体以及所述变体的用途，特别是用于合成包含3'‑OH‑修饰的核苷酸的核酸分子的用途，所述变体包含在至少一个特定位置处的残基的至少一个突变。

Variants of DNA Polymerase from the PolX Family

The present invention relates to a variant of a DNA polymerase capable of synthesizing a polX family of nucleic acid molecules without a template chain or a variant of the functional fragment of the polymerase and the use of the variant, in particular for synthesizing nucleic acid molecules containing 3'modified nucleotides containing at least one mutation of a residue

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】polX家族的DNA聚合酶的变体引言本专利技术属于酶增强领域。本专利技术涉及polX家族的DNA聚合酶的增强型变体，编码所述变体的核酸，所述变体在宿主细胞中的产生，所述变体用于在没有模板链的情况下合成核酸分子的用途，和用于在没有模板链的情况下合成核酸分子的试剂盒。核酸片段的化学合成是在实验室中广泛使用的技术(Adams等人,1983,J.Amer.Chem.Soc.105:661；Froehler等人,1983,TetrahedronLett.24:3171)。该技术能够快速产生包含所期望核苷酸序列的核酸分子。与在5'至3'方向上进行合成的酶不同，化学合成发生在3'至5'方向上。然而，化学合成具有某些缺陷。事实上，化学合成要求使用多于一种(multiple)溶剂和试剂。另外，仅能获得短核酸片段，然后必须对其进行组装以获得所期望的最终核酸链。已经开发了替代性解决方案，其使用能够从初始核酸片段(引物)且在不存在模板链的情况下进行核苷酸之间的偶联反应的酶。数种聚合酶似乎适合于此类合成方法。存在能够在有或没有模板链的情况下催化核酸链的合成的非常大量的DNA聚合酶。例如，polX家族的DNA聚合酶特别地以DNA修复机制或对DNA序列中出现的错误的校正机制参与广泛的生物学过程。这些酶能够将核苷酸引入已经历了在序列中的错误被鉴定之后的切除的核酸链。polX家族的DNA聚合酶包括DNA聚合酶β(Polβ)、λ(Polλ)、μ(Polμ)、来自酵母的IV(PolIV)和末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT)。特别是TdT被广泛用于酶促合成核酸分子的方法。然而，这些DNA聚合酶通常仅允许掺入天然核苷酸。在所有情况下，在非天然核苷酸特别是3'OH-修饰的核苷酸的存在下天然DNA聚合酶失去其催化活性，3'OH-修饰的核苷酸具有比天然核苷酸大的空间体积。然而，修饰的核苷酸的使用对于某些特定应用可能是有用的。因此，有必要开发能够催化通过掺入此类核苷酸来合成核酸链的酶。因此开发了DNA聚合酶的变体，目的是使用含有显著结构修饰的核苷酸。然而，目前可得的变体并不完全令人满意，特别是由于它们的低活性，仅与实验室规模的酶促合成相容。因此，如果可能的话，对于能够在在工业规模上、在不存在模板链的情况下并使用修饰的核苷酸合成核酸的DNA聚合酶存在需求。专利技术概述本专利技术消除了某些技术障碍，这些技术障碍妨碍了DNA聚合酶在工业规模用于核酸的酶促合成。因此，本专利技术提出了能够在模板链的不存在下合成核酸并且可以使用修饰的核苷酸的polX家族的DNA聚合酶的变体。开发的变体具有修饰的核苷酸的掺入能力，远远优于它们所源自的天然DNA聚合酶的修饰的核苷酸的掺入能力。特别地，本专利技术涉及的DNA聚合酶的变体对于掺入具有糖修饰的核苷酸特别有效。事实上，本专利技术人开发了与其所源自的DNA聚合酶的催化口袋体积相比具有增加的催化口袋体积的变体，所述变体促进了比天然核苷酸体积大的修饰的核苷酸的掺入。更准确地说，本专利技术涉及的polX家族的DNA聚合酶的变体包含氨基酸的至少一个突变，所述突变直接在酶的催化腔处干预或允许该腔的轮廓变形以便适应由于核苷酸中存在的修饰而变化的空间体积。例如，引入的突变使得扩大修饰的核苷酸的3′–OH末端所适合的酶的催化腔是可能的。可选地或另外地，所产生的突变使得可能使催化腔的体积膨大或增加，以增加3'-OH-修饰的核苷酸对催化口袋的接近和/或以赋予酶结构必要的柔性以允许其适应3'-OH-修饰的核苷酸的空间上显著的改变。由于此类突变，在聚合酶与待延长的核酸片段结合后，修饰的核苷酸进入催化口袋(其进入部位(access)被扩大)的核心并采取最佳空间构象，在核酸链的最后一个核苷酸的3'-OH末端与修饰的核苷酸的5'-三磷酸末端之间产生磷酸二酯键。因此，本专利技术涉及能够在没有模板链的情况下合成核酸分子的polX家族的DNA聚合酶的变体，或此类聚合酶的功能片段的变体，所述变体包含在选自由T331、G332、G333、F334、R336、K338、H342、D343、V344、D345、F346、A397、D399、D434、V436、A446、L447、L448、G449、W450、G452、R454、Q455、F456、E457、R458、R461、N474、E491、D501、Y502、I503、P505、R508、N509和A510组成的组的至少一个位置处的残基或功能等同的残基的至少一个突变，所示位置通过与SEQIDNO:1比对确定。在一个具体实施方案中，变体能够合成DNA链或RNA链。本专利技术特别涉及polX家族的DNA聚合酶的变体，并且特别是酵母PolIV、Polμ或野生型TdT的变体，并且所述变体包含所选择的突变。在一个具体实施方案中，根据本专利技术的变体是序列SEQIDNO:1的TdT的变体或具有与SEQIDNO:1的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的同源序列并且携带所选择的突变的变体。本专利技术还涉及编码根据本专利技术的polX家族的DNA聚合酶的变体的核酸、包含根据本专利技术的核酸的表达盒和包含根据本专利技术的核酸或表达盒的载体。编码本专利技术的变体的核酸可以是根据本专利技术的DNA聚合酶的成熟形式或前体形式的核酸。本专利技术还涉及根据本专利技术的核酸、表达盒或载体转化或转染宿主细胞的用途。本专利技术还涉及包含编码根据本专利技术的polX家族的DNA聚合酶的核酸、表达盒或载体的宿主细胞。本专利技术涉及此类核酸、表达盒、载体或宿主细胞产生根据本专利技术的polX家族的DNA聚合酶的变体的用途。本专利技术还涉及用于产生根据本专利技术的polX家族的DNA聚合酶的变体的方法，所述方法包括用根据本专利技术的核酸、表达盒或载体转化或转染宿主细胞，在允许编码所述变体的核酸表达的培养条件下培养转化/转染的宿主细胞，以及任选地收集由宿主细胞产生的polX家族的DNA聚合酶的变体。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。特别地，宿主细胞可以是微生物，优选地是细菌、酵母或真菌。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌，优选地是大肠杆菌(E.coli)。在另一个实施方案中，宿主细胞是酵母，优选地是巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis)。在另一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，优选地是COS7或CHO细胞。本专利技术还涉及根据本专利技术的polX家族的DNA聚合酶的变体由3'-OH-修饰的核苷酸在没有模板链的情况下合成核酸分子的用途。当然，根据本专利技术的polX家族的DNA聚合酶的变体也可以在本专利技术的背景中从未修饰的核苷酸或修饰的和未修饰的核苷酸的混合物在没有模板链的情况下合成核酸分子。本专利技术还提出了一种用于在没有模板链的情况下酶促合成核酸分子的方法，根据该方法，在根据本专利技术的polX家族的DNA聚合酶的变体的存在下，使引物链与至少一种核苷酸，优选地3'-OH-修饰的核苷酸接触。该方法尤其可以使用纯化的变体、被转化以表达所述变体的宿主细胞的培养物(culturemedium)和/或该宿主细胞的细胞提取物来实施。本专利技术还涉及一种用于在没有模板链的情况下酶促合成核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种根据本专利技术的polX家族的DNA聚合酶的变体、核苷酸，优选地3'-O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种polX家族的DNA聚合酶的变体或该聚合酶的功能片段的变体，所述聚合酶能够在没有模板链的情况下合成核酸分子，所述变体包含在选自由E457、T331、G332、G333、F334、R336、K338、H342、D343、V344、D345、F346、A397、D399、D434、V436、A446、L447、L448、G449、W450、G452、R454、Q455、F456、R458、R461、N474、E491、D501、Y502、I503、P505、R508、N509和A510组成的组的至少一个位置处的残基或功能等同的残基的至少一个突变，所示位置通过与SEQ ID NO:1比对确定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.14 FR 16554751.一种polX家族的DNA聚合酶的变体或该聚合酶的功能片段的变体，所述聚合酶能够在没有模板链的情况下合成核酸分子，所述变体包含在选自由E457、T331、G332、G333、F334、R336、K338、H342、D343、V344、D345、F346、A397、D399、D434、V436、A446、L447、L448、G449、W450、G452、R454、Q455、F456、R458、R461、N474、E491、D501、Y502、I503、P505、R508、N509和A510组成的组的至少一个位置处的残基或功能等同的残基的至少一个突变，所示位置通过与SEQIDNO:1比对确定。2.根据权利要求1所述的polX家族的DNA聚合酶的变体，所述变体能够合成DNA链和/或RNA链。3.根据权利要求1或2所述的polX家族的DNA聚合酶的变体，所述变体为PolIV、Polμ或末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT)的变体。4.根据前述权利要求之一所述的polX家族的DNA聚合酶的变体，所述变体与根据SEQIDNO:1的序列具有至少60％的同一性，优选地与根据SEQIDNO:1的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。5.根据前述权利要求之一所述的polX家族的DNA聚合酶的变体，其中至少一个突变由一个或更多个氨基酸残基的取代、缺失或添加组成。6.根据前述权利要求之一所述的polX家族的DNA聚合酶的变体，所述变体包含在选自由T331、G332、G333、F334、R336、D343、L447、L448、G449、W450、G452、R454、Q455、E457、R461和R508组成的组的至少一个位置处的残基或功能等同的残基的至少一个突变，优选地在选自由R336、R454和E457组成的组的至少一个位置处的残基或功能等同的残基的至少一个突变，所示位置通过与SEQIDNO:1比对确定。7.根据前述权利要求之一所述的polX家族的DNA聚合酶的变体，所述变体包含在选自由R336、R454和E457组成的组的至少两个位置处的残基的至少一个突变，优选地在所述三个位置R336、R454和E457处的残基的突变。8.根据前述权利要求之一所述的polX家族的DNA聚合酶的变体，所述变体具有在以下序列的至少一个半保守区域中的残基的至少一个突变(i)X1X2GGFR1R2GKX3X4(SEQIDNO:4)，其中X1表示选自M、I、V、L的残基X2表示选自T、A、M、Q的残基X3表示选自M、K、E、Q、L、S、P、R、D的残基X4表示选自T、I、M、F、K、V、Y、E、Q、H、S、R、D的残基(ii)X1X2LGX3X4GSR1X5X6ER2(SEQIDNO:5)其中X1表示选自A、C、G、S的残基X2表示选自L、T、R的残基X3表示选自W、Y的残基X4表示选自T、S、I的残基X5表示选自Q、L、H、F、Y、N、E、D或的残基X6表示选自F、Y的残基(iii)LX1YX2X3PX4X5RNA(SEQIDNO:6)X1表示选自D、E、S、P、A、K的残基X2表示选自I、L、M、V、A、T的残基X3表示选自E、Q、P、Y、L、K、G、N的残基X4表示选自W、S、V、E、R、Q、T、C、K、H的残基X5表示选自E、Q、D、H、L的残基。9.根据权利要求8所述的polX家族的DNA聚合酶的变体，所述变体具有-在序列SEQIDNO:4的半保守区域的R1、R2和/或K中的至少一个位置处的残基的至少一个取代；和/或-在序列SEQIDNO:5的半保守区域的S、R1和/或E中的至少一个位置处的残基的至少一个取代；和/或-在序列SEQIDNO:6的半保守区域的位置X1处的残基的缺失和/或在位置R和/或N处的至少一个取代。10.根据前述权利要求之一所述的polX家族的DNA聚合酶的变体，所述变体包...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·伊贝尔特，马克·德拉吕，
申请(专利权)人：DNA斯克瑞普特公司，巴斯德研究所，国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：法国,FR