与CD38和PD-L1结合的分子制造技术

本发明专利技术涉及一种双特异性分子，所述双特异性分子包含至少一个抗‑CD38结构域和至少一个抗‑PD‑L1结构域，其能够同时分别结合至CD38和PD‑L1抗原。

Molecules Binding to CD38 and PD-L1

The present invention relates to a bispecific molecule comprising at least one anti-CD38 domain and at least one anti-PD L1 domain, which can simultaneously bind to CD38 and PD L1 antigens, respectively.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】与CD38和PD-L1结合的分子本专利技术涉及CD38/PD-L1结合分子，特别是靶向CD38和PD-L1的抗体，用于生产这些分子的方法，以及其组合物和用途。
技术介绍
多发性骨髓瘤(MM)是第三常见的血液系统恶性肿瘤，每年全球有114,000例患者。尽管取得了治疗进展，但是MM仍是为数不多的具有未满足的医疗需求的血液系统恶性肿瘤之一。一旦患者在经过一线治疗后出现疾病进展，且患有复发性或难治性(r/r)疾病，治疗选择是非常有限的。然而，近年来已开发出抗-MM肿瘤靶抗原(TAA)抗体。一种抗-CD38抗体达雷木单抗(daratumumab)已被批准用于治疗患有复发性MM的患者，其他抗-CD38抗体目前正在开发中(isatuximab和MOR-202，在美国专利US8,263,746中对其进行了描述)。然而，需要改善目前在30-35％范围内的应答。已证实可以通过免疫调节疗法(例如，来那度胺)增强抗-CD38抗体的活性，免疫调节疗法刺激患者的免疫系统。而且，已证实MM肿瘤细胞对抗体疗法耐受的机制之一与检验点抑制剂通路(例如，PD-1/PD-L1)信号增强有关。因此，有机会增强抗-CD38抗体对MM肿瘤细胞的细胞毒性，同时通过抑制检验点抑制剂通路(例如，PD-1/PD-L1)激活免疫系统。在生理条件下，PD-L1通过下调免疫系统起到防止自身免疫的重要作用。其在“APC样”免疫细胞(T细胞、NK细胞、巨噬细胞、髓样DC、B细胞、上皮细胞、血管内皮细胞)和肿瘤细胞上表达。PD-L1与其同源受体PD-1和B7-结合，并且通过抑制其增殖和活化负向调控免疫细胞(T细胞、NK细胞等)。在病理条件下，PD-L1由肿瘤细胞高表达(>90％MM患者)并且与预后不良相关。已证实靶向免疫检验点通路的阻断抗体(抗-PD-1、抗-CTLA-4、抗-PD-L1等)在多种不同类型的癌症中(肺癌、黑色素瘤等)显示出显著的活性。已在MM中观察到了有效性的迹象，但是这类有希望治疗剂的活性在MM中仍是欠佳的。其中的一个原因可能是具有有益活性/副作用性质的分子(例如，抗-PD-L1)需要接近化学计量的阻断/饱和其靶点以便对T细胞激发最大的免疫刺激作用。因此，将抗-PD-L1抗体特异性靶向肿瘤部位(例如，靶向CD38+癌细胞)可能有助于将抗-PD-L1治疗剂递送至需要免疫刺激的部位，并且可以产生使得肿瘤和微环境细胞中的PD-L1完全阻断的最大免疫细胞刺激。在肿瘤部位的这种靶向免疫细胞活化还可以降低免疫细胞的系统活化、防止不良副作用以及允许更高剂量的治疗性抗体。
技术实现思路
为了利用T细胞、BK细胞和其他免疫细胞的细胞毒性能力治疗多发性骨髓瘤(MM)和其他癌症(优选CD38+癌症)，设计了具有两个结合位点(分别特异性针对CD38和PD-L1)的双特异性分子。本专利技术的双特异性分子消除了与T细胞和NK细胞上的PD-1与在肿瘤和肿瘤微环境细胞上表达的PD-L1的相互作用相关的免疫系统抑制。这种分子在治疗癌症中是有用的，特别是多发性骨髓瘤或者任意CD38+癌症，其过表达PD-L1并且在表达PD-L1的免疫细胞(浆细胞样树突状细胞，髓细胞来源的抑制细胞)微环境中生长，在这种微环境中进一步抑制T细胞和NK细胞。本专利技术的分子促进CD38+/PD-L1+肿瘤细胞以及肿瘤微环境细胞中的PD-L1+细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用以及补体依赖性细胞毒性(CDC)。在本专利技术的一个实施方式中，工程化改造了若干包含抗-CD38和抗-PD-L1结构域的双特异性CD38/PD-L1分子。这些双特异性CD38/PD-L1分子能够同时与这两个抗原结合。更具体地，工程化改造了包含抗-CD38和抗-PD-L1结构域的双特异性CD38/PD-L1抗体。这些双特异性CD38/PD-L1抗体能够同时与这两个抗原结合。在一个优选的实施方式中，在CHO细胞中表达双特异性CD38/PD-L1抗体，并通过使用蛋白A树脂的亲和层析对其进行纯化。在体外测定中表征抗体结合性质。其在ELISA测定中同时结合CD38和PD-L1。将具有图1A或1B结构的双特异性四价四Fab抗体称为，其为BiomunexTherapeutics公司的商标。本专利技术的抗体是针对CD38和PD-L1双特异性的和二价的。本专利技术的抗原结合双特异性抗体是由连续的“复合重链”(由mAbIgG的天然重链，随后为接头以及mAb2的Fab重链构成)组成的全长双特异性抗体，所述“复合重链”由Fc(铰链-CH2-CH3)，然后是抗体1的Fab重链(CH1-VH)和抗体2连续的Fab重链(CH1-VH)构成，后者通过铰链来源的多肽接头序列连接在一起，在蛋白表达过程中产生的复合重链与相同的另一条复合重链结合，同时共表达的抗体2和抗体1的Fab轻链(LC)与其同源重链结构域结合以形成最终的串联F(ab')2-Fc分子；抗体1(Ab1)和抗体2(Ab2)是不同的并且选自由抗-CD38抗体(达雷木单抗、isatuximab、MOR-202或任意其他抗-CD38抗体)或其突变衍生物和抗-PD-L1抗体(阿特珠单抗、durvalumab、avelumab、MDX-1105或任意其他抗-PD-L1抗体)或其突变衍生物组成的组。抗体能够与CD38和PD-L1双价结合。进一步描述了由如上文所述的双特异性抗体的重链构成的多肽，以及包含编码所述多肽的序列的多核苷酸。还描述了使用包含所述多肽核苷酸的表达载体转染的宿主细胞。本专利技术的又一个目的是提供一种用于制备本专利技术的双特异性抗体的方法。因此，提供了一种用于生产本专利技术的双特异性抗体的方法，所述方法包括下述步骤：a)在适宜培养基中和培养条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞表达如上文所定义的抗体重链以及如上文所定义的抗体轻链，以及b)从所述培养基中或从所述所培养的细胞中回收所述所生产的抗体。本专利技术利用重组载体，特别是表达载体，所述表达载体包含编码本申请所定义的重链和轻链的多核苷酸以及在所选择的宿主细胞中具有活性的转录和翻译控制元件。能够用于构建根据本专利技术的表达载体的载体本身是已知的，并且将根据意欲使用的宿主细胞的功能特别地对其进行选择。优选地，使用编码重链的多核苷酸以及编码两条不同轻链的两个多核苷酸转化所述宿主细胞。可以将所述多核苷酸插入相同的表达载体中或者单独的表达载体中。用于生产本专利技术抗体的方法包括培养此类宿主细胞以及从所述培养物中回收所述抗原结合片段或抗体。附图说明图1A和1B是本专利技术的双特异性抗体的示意图，所述双特异性抗体包含两条重链和四条轻链。图2显示了在还原条件下双特异性抗体BiXAbs4218、4219和5104的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图3显示了在非还原条件下双特异性抗体BiXAbs4218、4219和5104的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图4显示了BiXAbs4218和4219的ELISA结合试验。图5显示了在还原和非还原条件下BiXAb-6567的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。第1道：在还原条件下BiXAb-6567的迁移情况；第2道：以每个条带的重量表示的分子量标记物；第3道：在非还原条件下BiXAb-6567的迁移情况。图6显示了BiXAb-6567的体积排阻色谱分析结果。图7显示了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双特异性分子，所述双特异性分子包含至少一个抗‑CD38结构域和至少一个抗‑PD‑L1结构域，其能够同时分别结合至CD38和PD‑L1抗原。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.25 EP 16305350.71.一种双特异性分子，所述双特异性分子包含至少一个抗-CD38结构域和至少一个抗-PD-L1结构域，其能够同时分别结合至CD38和PD-L1抗原。2.根据权利要求1所述的双特异性分子，所述双特异性分子是抗体或其片段。3.根据权利要求2所述的双特异性分子，所述双特异性分子是全长抗体，所述抗体包含两条重链和四条轻链，其中每条重链包含a.含有铰链-CH2-CH3结构域的Fc区，b.其Fc区与抗体1(Ab1)的Fab重链(CH1-VH)连接，c.其还通过来自铰链的多肽接头序列与抗体2(Ab2)的Fab重链(CH1-VH)连接，其中所述多肽接头序列将所述Ab1的Fab重链VH结构域的N-末端与所述Ab2的CH1结构域的C-末端连接，以及所述四条轻链包含Ab1的Fab轻链(CL-VL)和与其同源重链结构域结合的Ab2的Fab轻链(CL-VL)；Ab1和Ab2是不同的，并且选自由抗-CD38抗体和抗-PD-L1抗体组成的组。4.根据权利要求3所述的双特异性分子，其中Ab1是抗-CD38抗体和Ab2是抗-PD-L1抗体。5.根据权利要求3所述的双特异性分子，其中Ab1是抗-PD-L1抗体和Ab2是抗-CD38抗体。6.根据权利要求3至5中任意一项所述的双特异性分子，其中所述抗-CD38抗体选自下组：达雷木单抗(daratumumab)、isatuximab、MOR-202或其突变衍生物。7.根据权利要求3至6中任意一项所述的双特异性分子，其中所述抗-PD-L1抗体选自下组：阿特珠单抗(atezolizumab)、durvalumab、avelumab、MDX-1105或其突变衍生物。8.根据权利要求3至7中任意一项所述的双特异性分子，其中所述Ab1的CH1和CL结构域具有与所述Ab2的CH1和CL结构域不同的序列。9.根据权利要求3至7中任意一项所述的双特异性分子，其中所述A...

【专利技术属性】
技术研发人员：E朱科夫斯基，O莱格尔，RJ莫尔斯，
申请(专利权)人：拜奥穆尼克斯制药，
类型：发明
国别省市：法国,FR