脑部递送蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种脑部递送蛋白，所述脑部递送蛋白包含与哺乳动物脑中的靶结合的靶结合抗体；两个载体部分，所述两个载体部分中的每一个能够与在血脑屏障(BBB)内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用，其中所述载体部分中的每一个连接至靶结合抗体的C末端。本发明专利技术还涉及这样的脑部递送蛋白在例如神经退行性紊乱和其他脑部疾病的治疗或诊断中的用途或用于研究例如神经退行性紊乱和其他脑部疾病的用途。

Brain Delivery Protein

The present invention relates to a brain delivery protein, which contains target-binding antibodies that bind to targets in mammalian brains; two carrier parts, each of which can interact univalently with proteins expressed on blood brain barrier (BBB) endothelial cells, each of which is connected to the C terminal of target-binding antibodies. The invention also relates to the use of such brain delivery proteins for the treatment or diagnosis of neurodegenerative disorders and other brain diseases, or for the study of such neurodegenerative disorders and other brain diseases.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脑部递送蛋白
本专利技术涉及脑部递送蛋白，所述脑部递送蛋白使得与脑中的靶结合的蛋白诸如抗体能够转运跨越血脑屏障。背景血脑屏障(BBB)包含紧密连接的内皮细胞，并且通过将小的药物样分子和较大分子如蛋白保持在脑外来充当脑的保护者。虽然对于脑内稳态是必需的，但该屏障的存在是治疗和诊断脑中的疾病的障碍。例如，由于BBB的紧密连接的内皮细胞，仅约0.1％的未修饰的抗体进入脑(BardF.等，Nat.Med.6:916-919(2000))。然而，已经描述了一些蛋白从血液主动转运跨越BBB进入脑。一个这样的实例是经由位于BBB的转铁蛋白受体(TfR)将铁转运至脑的转铁蛋白。转铁蛋白-TfR复合物在BBB的腔侧(luminalside)形成，并且随后被内吞。铁在其中pH较低的核内体中与转铁蛋白解离。没有结合的铁的转铁蛋白(脱铁转铁蛋白)对TfR具有低亲和力并且在BBB的腔外侧(abluminalside)与铁一起释放。不仅是转铁蛋白，与TfR结合的其他蛋白也可从BBB的腔侧被内吞到腔外侧，并且该机制可以用于将分子主动转运到脑中(BoadoRJ等，Biotechnol.Bioeng.102:1251-1258(2009)；PardridgeWM，ExpertOpin.DrugDeliv.12:207-222(2015))。为了避免在溶酶体中降解，与TfR结合的蛋白/抗体在核内体中与受体解离是必需的。已经提出，对于显示出pH依赖性亲和力的结合物，核内体中的低pH环境可促进与TfR的解离(SadeH.等，PLOSone4：e96340(2014))。当对TfR的总体亲和力是中等或低时，解离也是更加可能的(YuYJ.等，Sci.Transl.Med.3:84ra44(2011))。还发现与靶的二价结合是不利的(NiewoehnerJ.等，Neuron81:49-60(2014))。抗体二价结合降低了与TfR解离的速率，因为抗体解离需要从两个表位(结合位点)同时解离，即亲合力效应。先前已经公开了一种双特异性蛋白，该双特异性蛋白由与TfR抗体8D3化学缀合的抗淀粉样蛋白β原纤维抗体(被称为mAb158)组成(SehlinD.等，Nat.Commun.7:10759(2016))。该蛋白在注射后3天显示出与mAb158相比20倍更高的脑部浓度与血液浓度的比率。发现增加的比率部分地由于脑部浓度增加，并且部分由于与mAb158相比血液中半衰期缩短。对BBB受体具有低亲和力的抗体先前已在WO2012/075037中公开。此外，该出版物公开了对于结合TfR和淀粉样蛋白前体蛋白(APP)裂解酶β分泌酶(BACE1)二者的双特异性抗体(抗TfRA/BACE1)，观察到在以示踪剂量施用和以治疗剂量施用之间的脑部摄取的差异。在WO2014/033074中公开了BBB抗体穿梭物的另一种变体。BBB穿梭物包含脑部效应物实体、接头和结合TfR的一个单价结合实体，其中接头将效应物实体偶联至结合TfR的单价结合实体。为了提供脑部疾病的改进的治疗和诊断以及用于研究的目的，仍然需要具有改进的摄取的蛋白/抗体。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供用于治疗和诊断脑部疾病以及用于研究目的的新型蛋白。在本专利技术的第一方面中，提供了脑部递送蛋白，该脑部递送蛋白包含：靶结合抗体或其片段，所述靶结合抗体或其片段与哺乳动物脑中的靶结合；两个载体部分，所述两个载体部分中的每一个能够与在血脑屏障(BBB)内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用，其中所述载体部分中的每一个连接至靶结合抗体的C末端。如本文所公开的脑部递送蛋白包含两种类型的部分；与脑中的靶结合的靶结合抗体和使得脑部递送蛋白能够转运跨越BBB进入脑中的两个载体部分。两个载体部分能够与在BBB内皮细胞上的蛋白进行单价相互作用或与在BBB内皮细胞上的蛋白单价结合。单价相互作用或结合表明在载体部分与在BBB内皮细胞上表达的蛋白之间的相互作用通过一个单一表位发生。由于脑部递送蛋白的结构，通常一次仅一个载体部分可与BBB上表达的蛋白结合。这可继而防止与BBB蛋白的二价、高亲合力结合并且引起更有效的BBB转移，并且还可防止BBB蛋白的任何二聚化/构象变化。在一个实施方案中，一次所述两个载体部分中的一个与在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白结合。因此，能够实现这样的脑部递送蛋白与在BBB内皮细胞上表达的蛋白的单价相互作用。因此，尽管具有潜在地可以与所述BBB蛋白结合的两个载体部分，但通过维持单价结合，可增加跨越BBB的转运的效率。与仅包含一个载体部分的脑部递送蛋白相比，通过使两个载体部分与靶结合抗体连接，针对在BBB细胞上表达的蛋白的可用结合位点的数量将加倍。此外，在小鼠中进行的剂量实验证明，根据本专利技术的包含两个载体部分的脑部递送蛋白以治疗剂量和示踪剂量二者均改进了脑部摄取(实施例2)。与无载体部分的“裸”靶结合抗体(RmAb158)的脑部摄取相比，发现在实施例2中研究的特异性脑部递送蛋白RmAb158-scFv8D3(具有两个单链TfR结合抗体(scFv8D3))以示踪剂量在注射后2小时将脑部摄取提高了约80倍。对于RmAb48-scFv8D3，已经获得类似结果(实施例5)。发现治疗剂量的RmAb158-scFv8D3的脑部摄取比相应的裸靶结合抗体的脑部摄取高10倍。推测该差异可能至少部分地取决于具有两个TfR结合部分的脑部递送蛋白。相比之下，现有技术的脑部穿梭物已证明示踪剂量的抗TfR抗体的摄取增加约40倍，而治疗剂量的相同穿梭物的脑部摄取仅增加1.4倍(Yu等，同上，(2011))。这可能是由于TfR系统以治疗剂量达到饱和。然而，先前已经公开了作为BBB穿梭物的基于CD98的脑穿梭物的类似结果。发现示踪剂量的摄取比无CD98的抗体高80倍，但治疗剂量的摄取仅高3.2倍(ZucheroYJY.等，Neuron89:70-82(2016))。如本文所公开的脑部递送蛋白的载体部分在靶结合抗体的C末端连接至靶结合抗体。载体部分优选位于靶结合抗体的重链或轻链的C末端。优选地，载体部分连接至靶结合抗体的单独的链，优选地连接至单独的轻链或单独的重链。根据一个实施方案，所述载体部分中的每一个通过接头连接至靶结合抗体。用于将载体部分连接至靶结合抗体的接头可以相同或不同，即它们可具有相同的长度和/或氨基酸序列，或者它们可具有不同的长度和/或氨基酸序列。具体地，就所述载体部分中的每一个而言，所述接头中的每一个单独地包含具有由1-30个氨基酸残基、优选1-25个氨基酸残基、优选1-19个氨基酸残基、优选3-19个氨基酸残基、优选3-15个氨基酸残基、优选5-15个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽。接头的一个实例是具有11个氨基酸的接头。这样的接头长度已在所附实施例中使用。因此，所述接头优选是相对短的肽。然而，接头的长度可取决于接头在靶结合抗体上的具体位置而不同。短的接头可以是有利的，因为载体部分与在内皮BBB细胞上表达的蛋白，例如二聚受体的二价结合可进一步在空间上受阻。与二价结合相比，与在BBB内皮细胞上表达的蛋白的单价结合可以提供跨越BBB的改进的转移。二价结合降低解离速率，这继而可增加结合的可能性并因此增加结合时间，即导致BBB转运减少的亲合力本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.脑部递送蛋白，所述脑部递送蛋白包含靶结合抗体，所述靶结合抗体与哺乳动物脑中的靶结合；两个载体部分，所述两个载体部分中的每一个能够与在血脑屏障(BBB)内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用，其中所述载体部分中的每一个连接至所述靶结合抗体的C末端。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.14 SE 1651065-31.脑部递送蛋白，所述脑部递送蛋白包含靶结合抗体，所述靶结合抗体与哺乳动物脑中的靶结合；两个载体部分，所述两个载体部分中的每一个能够与在血脑屏障(BBB)内皮细胞上表达的蛋白进行单价相互作用，其中所述载体部分中的每一个连接至所述靶结合抗体的C末端。2.根据权利要求1所述的蛋白，其中一次所述两个载体部分中的一个与在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白结合。3.根据权利要求1或2所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个通过接头连接至所述靶结合抗体。4.根据权利要求3所述的蛋白，其中所述接头中的每一个单独地包含具有由1-30个氨基酸残基、优选1-25个氨基酸残基、优选1-19个氨基酸残基、优选3-19个氨基酸残基、优选3-15个氨基酸残基、优选5-15个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽。5.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个连接至所述靶结合抗体的轻链的C末端。6.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个连接至所述靶结合抗体的重链的C末端。7.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白，其中第一载体部分连接至所述靶结合抗体的重链的C末端，并且第二载体部分连接至所述靶结合抗体的轻链的C末端。8.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个通过接头连接至所述靶结合抗体，所述接头包含具有SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列的肽。9.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个包含选自scFv、Fv、scFab或VHH的抗体片段；转铁蛋白或其突变体或变体，或衍生自葡萄球菌蛋白A的结构域B的蛋白Z的变体。10.根据权利要求9所述的蛋白，其中所述载体部分中的每一个包含scFv。11.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白选自转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体(InsR)、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8(Lrp8)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Lrp1)、CD98、跨膜蛋白50A(TMEM50A)、葡萄糖转运蛋白1(Glut1)、basigin(BSG)和肝素结合表皮生长因子样生长因子。12.根据权利要求11所述的蛋白，其中在BBB内皮细胞上表达的所述蛋白是TfR。13.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述靶结合抗体是全长抗体、Fab、F(ab')2或Fv。14.根据权利要求13所述的蛋白，其中所述靶结合抗体是全长抗体。15.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述脑中的靶选自淀粉样蛋白β(Aβ)肽、α突触核蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、亨廷顿蛋白、转甲状腺素蛋白、P-分泌酶1、表皮生长因子、表皮生长因子受体2、Tau、磷酸化Tau、载脂蛋白E4、CD20、朊蛋白、富含亮氨酸重复序列激酶2、帕金蛋白、早老素2、γ分泌酶、死亡受体6、淀粉样蛋白前体蛋白、p75神经营养蛋白受体、神经调节蛋白和胱天蛋白酶6。16.根据权利要求15所述的蛋白，其中所述脑中的靶是Aβ肽，优选可溶性Aβ聚集体，诸如选自低聚物和原纤维的可溶性Aβ聚集体。17.根据权利要求16所述的蛋白，所述蛋白包含Aβ结合抗体，并且两个载体部分是抗TfR抗体的片段。18.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉尔斯·兰费尔特，达格·塞林，格里塔·胡尔特奎斯特，斯蒂娜·叙韦宁，
申请(专利权)人：生命北极公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE