基因递送的改进方法技术

本发明专利技术提供了用于对靶细胞进行基因递送或遗传修饰的改进方法，其中对靶细胞的基因递送或其它遗传修饰在内皮细胞的存在下进行，或在靶细胞与内皮细胞共培养后进行，或者，其中在基因递送后立即将靶细胞与内皮细胞共培养以便对在基因递送过程中可能被破坏的细胞进行拯救。在一些实施方式中，基因递送通过转染来进行。在一些实施方式中，基因递送通过转导来进行。在一些实施方式中，内皮细胞是器官特异性的内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞为表达E4ORF1的内皮细胞(E4ORF1+EC)。在一些实施方式中，靶细胞是干细胞，例如造血干细胞。

An improved method of gene delivery

The present invention provides an improved method for gene delivery or genetic modification of target cells, in which gene delivery or other genetic modification of target cells is carried out in the presence of endothelial cells, or after co-culture of target cells and endothelial cells, or in which target cells and endothelial cells are co-cultured immediately after gene delivery in order to break down during gene delivery. Bad cells are saved. In some embodiments, gene delivery is performed by transfection. In some embodiments, gene delivery is performed by transduction. In some embodiments, endothelial cells are organ-specific endothelial cells. In some embodiments, endothelial cells are endothelial cells expressing E4ORF1 (E4ORF1+EC). In some embodiments, the target cells are stem cells, such as hematopoietic stem cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因递送的改进方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年4月15日提交的美国临时专利申请No.62/323,476，以及2016年10月1日提交的美国临时专利申请No.62/403,110的优先权，其内容在此以引用的方式整体并入本文。通过引用的方式并入仅用于那些允许通过引入的方式并入的行政辖区，本申请中引用的所有参考文献(包括但不限于出版物，专利申请，专利和其他参考文献)，其全文以引用的方式整体并入本文。此外，本文引用或提及的任何产品的任何制造商说明书或目录都通过引用并入本文。在美国专利No.8,465,732中提供的许多教导可以与本专利技术结合使用，或可适用于本专利技术。因此，美国专利No.8,465,732的全部内容通过引用明确并入本申请。通过引用并入本文中的文件，或其中的任何教导，可用于本专利技术的实践中。
技术介绍
腺病毒早期4(E4)区包含至少6个开放阅读框(ORF)。已报道整个E4区可以调节血管生成和促进内皮细胞存活(Zhangetal.(2004)，J.Biol.Chem.279(12)：11760-66)。在整个E4区内，E4ORF1序列负责内皮细胞中的这些生物学效应(美国专利No.8,465,732；和Seandeletal.(2008)，PNAS，105(49)：19288-93)。已经发现，被工程化为表达E4ORF1的内皮细胞在多种共培养方法中是特别有用的，其中它们可用于支持各种不同细胞类型的扩增，否则这些细胞类型难以在培养物中维持或扩增，如各种干细胞，包括造血干细胞(美国专利No.8,465,732；和Seandeletal.(2008)，PNAS，105(49)：19288-93)。基因治疗，例如采用基因编辑技术，为对抗大量的遗传障碍和疾病提供一种有前景的潜在解决方案。然而，本领域克服的主要障碍是高效地遗传修饰足够数量的用于移植的自体细胞，以及修饰最有可能是治疗有效的细胞类型的能力。在用于血液紊乱的基因治疗中，这种细胞类型包括造血干细胞(HSC)和组织特异性的再填充干细胞(tissue-specificrepopulatingstem)和祖细胞。采用针对该关键造血细胞群的基因修正和其它基因治疗技术，可以更有效地治疗几种血液紊乱。不幸的是，到目前为止已经证明在这些和其它细胞中的基因修正的尝试大部分是无效率的。几种细胞转导和转染技术(如电穿孔)可引起显著的细胞应激和细胞损伤，这经常会导致细胞死亡。因此，通常只有部分细胞被成功转导或转染。这是基因递送至干细胞中的特殊问题，并且在需要大量健康的，有活力的，转导的或转染的细胞的应用中也是一个特定的问题。
技术实现思路
本专利技术部分地基于在本专利公开的“实施例”这一部分中进一步描述的某些新发现和过程。例如，现已发现，当基因递送与内皮细胞共培养(例如与已被优化为能在体外(exvivo)培养的内皮细胞(如表达E4ORF1基因(E4ORF1+EC)的内皮细胞)共培养)相结合进行时，可以显著提高基因递送至“靶细胞”的效率，和/或成功转染的或转导的靶细胞(包括干细胞)的产量。据申请人所知，没有关于内皮细胞，更具体地为E4ORF1+ECs在基因递送至其它“靶”细胞类型(例如，与E4ORF1+EC共培养的细胞)的效率上，和/或在成功转染的或转导的靶细胞的产量上，和/或在基因递送过程中“拯救”损伤的细胞的能力上的影响的报道。此外，当基因递送过程在内皮细胞，特别是在E4ORF1+EC存在下进行时，基因递送效率和/或成功转导的或转染的细胞的产量不会受到不利影响，甚至可以被提高，这一发现似乎是反直觉的——因为人们可能期望内皮细胞(例如E4ORF1+EC)摄取原本可由靶细胞摄取的遗传物质，从而显著降低基因递送至靶细胞的整体效率和/或显著降低成功转导的或转染的细胞的产量。然而，在此呈现的结果证明情况并不是这样的。相反，本文呈现的结果证明，与仅包含靶细胞的培养物相比，在含有内皮细胞(尤其是E4ORF1+EC)的培养物中，基因递送至靶细胞的效率，和/或成功转导的或转染的细胞的产量，要远远大于所期望的——即使递送至培养物的遗传物质的总量相同以及培养物中的靶细胞的相对比例降低。基于这些发现，本专利技术提供了用于基因递送的特定的新的和改进的方法，以及可用于这些方法的各种组合物。因此，在一个实施例中，本专利技术提供了一种基因递送至靶细胞的方法，所述方法包括：(a)将靶细胞与内皮细胞(如E4ORF1+内皮细胞)共培养，(b)将所述靶细胞与用于基因递送/基因编辑的一种或多种外源核酸分子和/或其它分子接触；其中将靶细胞与内皮细胞(如E4ORF1+内皮细胞)共培养的步骤，在以下任一情况下进行：(i)在将靶细胞与一种或多种外源核酸分子和/或其它分子接触之前进行，(ii)与将靶细胞与一种或多种外源核酸分子和/或其它分子接触的同时进行，(iii)在将靶细胞与一种或多种外源核酸分子和/或其它分子接触之后进行，或(iv)上述任意组合。在一些这样的实施例中，所述基因递送是基因编辑过程的一部分，并且还可包括将所述靶细胞与用于基因编辑的一种或多种分子接触。在一些这样的实施例中，靶细胞与内皮细胞(例如E4ORF1+内皮细胞)共培养(例如，它们与靶细胞存在于相同容器中，和/或与靶细胞相接触)，与此同时，靶细胞与一种或多种外源核酸分子和/或其它分子接触。在一些这样的实施例中，在将靶细胞与一种或多种外源核酸分子和/或其它分子接触之前，将靶细胞与内皮细胞(例如E4ORF1+内皮细胞)共培养至少12小时，或至少24小时(1天)，或至少36小时，或至少48小时(2天)或至少60小时，或至少72小时(3天)，或至少84小时，或至少96小时(4天)。在一些这样的实施例中，靶细胞与内皮细胞(例如E4ORF1+内皮细胞)的共培养在将靶细胞与在基因递送/基因编辑中有用的一种或多种外源核酸分子或其它分子接触后立即开始——以便及时使靶细胞免受基因递送过程中的任何损伤。在本文中，术语“立即”是指在完成“接触”步骤的30分钟内。在一些实施例中，靶细胞与内皮细胞(例如E4ORF1+内皮细胞)的共培养在完成所述“接触”步骤的15分钟内，或10分钟内，或5分钟内，或3分钟内，或2分钟内，或1分钟内开始。根据所采用的基因递送方法不同，所述“接触”步骤的完成时间也不同。例如，当通过电穿孔实现基因递送时，当电脉冲结束时，即完成“接触”步骤，且在电脉冲结束后，靶细胞应与内皮细胞共培养。类似地，当通过将靶细胞与脂质转染药剂接触来实现基因递送时，当脂质转染药剂被去除时(例如通过介质置换)，即完成“接触”步骤，且在脂质转染药剂去除后，靶细胞应与内皮细胞共培养。在一些这样的实施例中，在接触步骤完成后，靶细胞继续与内皮细胞(例如E4ORF1+内皮细胞)共培养至少2小时，至少6小时，至少12小时，至少24小时(1天)，或至少48小时(2天)，或至少72小时(3天)，或至少96小时(4天)，或至少120小时(5天)，或至少144小时(6天)，或至少168小时(7天)，或至少192小时(8天)，或至少240小时(10天)，或至少288小时(12天)。在一些实施例中，在共培养过程中，靶细胞与内皮细胞(例如E4ORF1+内皮细胞)的比例约为1∶1。在一些实施例中，在共培养过程中，靶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将基因递送至靶细胞的方法，所述方法包括：(a)将靶细胞与内皮细胞共培养，以及(b)将靶细胞与一种或多种外源核酸分子接触，其中，所述将靶细胞与内皮细胞共培养的步骤为：i.在将靶细胞与一种或多种外源核酸分子接触之前开始，或ii.在将靶细胞与一种或多种外源核酸分子接触的同时开始，或iii.在将靶细胞与一种或多种外源核酸分子或分子接触之后开始，iv.或其任意组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.15 US 62/323,476;2016.10.01 US 62/403,1101.一种将基因递送至靶细胞的方法，所述方法包括：(a)将靶细胞与内皮细胞共培养，以及(b)将靶细胞与一种或多种外源核酸分子接触，其中，所述将靶细胞与内皮细胞共培养的步骤为：i.在将靶细胞与一种或多种外源核酸分子接触之前开始，或ii.在将靶细胞与一种或多种外源核酸分子接触的同时开始，或iii.在将靶细胞与一种或多种外源核酸分子或分子接触之后开始，iv.或其任意组合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞也与在基因编辑中有用的一种或多种分子接触。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为E4ORF1+内皮细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述共培养步骤在常氧条件下进行。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述共培养步骤在低氧条件下进行。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述共培养步骤在严重低氧条件下进行。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述共培养步骤在氧含量为0.1％至18％条件下进行。8.根据权利要求1所述的方法，还进一步包括将所述靶细胞与一种或多种外源核酸酶接触。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述核酸酶选自归巢核酸内切酶，锌指核酸酶，转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas系统核酸酶。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞为分化的细胞。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞为干细胞或祖细胞。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞为造血干细胞(HSC)。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞为造血干/祖细胞(HSPC)。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述HSC或HSPC为CD34+。15.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述HSC或HSPC来源于骨髓，外周血或脐带血。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞为骨髓来源的CD34+HSC或HSPC。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为血管内皮细胞。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为初级血管内皮细胞。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为哺乳动物内皮细胞。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为人内皮细胞。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为完全分化的内皮细胞。22.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为器官特异性内皮细胞。23.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞是有丝分裂失活的。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为脐静脉内皮细胞。25.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞为人脐静脉内皮细胞。26.根据权利要求1所述的方法，其中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·威廉·芬尼根，克劳德·杰弗里·戴维斯，迈克尔·丹尼尔·金斯伯格，丹尼尔·约瑟夫·诺兰，
申请(专利权)人：安吉克莱茵生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US