本发明专利技术公开了一种母乳多克隆抗体免疫亲和柱及其制备方法，所述母乳多克隆抗体是以去除脂肪的母乳作为免疫原制备得到，以此母乳多克隆抗体与固相配体支持物制备亲和吸附剂，加入到层析柱中，经洗涤、封闭、平衡后制得母乳多克隆抗体免疫亲和柱。本发明专利技术制备方法简单，能够对母乳中丰度相对较低、在质谱中的信号较低的蛋白进行富集，有利于人类更加正确的认识母乳的蛋白轮廓，能应用于母乳蛋白质组学下游的相关技术方面，值得大面积推广和应用。
A polyclonal antibody immunoaffinity column for breast milk and its preparation method
The invention discloses a polyclonal antibody immunoaffinity column for breast milk and a preparation method thereof. The polyclonal antibody for breast milk is prepared by removing fat from breast milk as an immunogen, and the affinity adsorbent is prepared by using the polyclonal antibody for breast milk and solid ligand support. The affinity column for breast milk polyclonal antibody is prepared by washing, sealing and balancing. The preparation method of the present invention is simple, can enrich proteins with relatively low abundance and low signal in mass spectrometry, is conducive to human understanding of the protein profile of breast milk more correctly, and can be applied to the downstream related technology of breast milk proteomics, and is worthy of wide promotion and application.
【技术实现步骤摘要】
一种母乳多克隆抗体免疫亲和柱及其制备方法
本专利技术属于免疫亲和层析
更具体地，涉及一种母乳多克隆抗体免疫亲和柱及其制备方法。
技术介绍
母乳作为婴儿理想的天然食物，除了蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、微量元素等，为婴儿生长发育提供能量与营养物质外，还含有丰富的生物活性物质，在增强婴儿抗感染能力、促进组织器官发育、建立自身免疫系统乃至调节婴儿社会行为等多方面发挥着重要的生物学功能。通过母乳蛋白质组学的研究，揭示母乳中具有生物活性的蛋白质，对认识母乳中蛋白质的轮廓和完善婴儿奶粉的配方具有关键性意义。但是这些具有生物活性的蛋白质，其丰度相对较低，况且低丰度蛋白在质谱中的信号较低，不利于人类更加正确认识母乳的蛋白质轮廓。因此目前除去高丰度蛋白、富集低丰度蛋白是解决研究瓶颈的主要策略。传统的蛋白质分离富集方法己经无法满足日益增长的技术需求，尤其体现在低丰度蛋白、糖基化后修饰蛋白和高分子量蛋白的分离分析方面。王静等的研究《利用免疫亲和层析技术去除母乳中高丰度蛋白的研究》中建立了一种去除母乳中高丰度蛋白的方法,使低丰度蛋白得到富集，但是该研究制备的免疫亲和层析柱一定程度上能够去除母乳中的4种高丰度蛋白，洗脱效果分离效果较差。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有母乳中高丰度蛋白去除及低丰度蛋白富集技术的缺陷和不足，提供一种母乳多克隆抗体，并基于该抗体构建了免疫亲和柱，能够更有效地去除母乳中的高丰度蛋白，对母乳中丰度相对较低、在质谱中的信号较低的蛋白进行富集，有利于人类更加正确的认识母乳的蛋白轮廓，能应用于母乳蛋白质组学下游的相关技术方面。本专利技术的目的是提供一种母乳多克隆抗体。本专利技术另一目的是提供一种利用上述母乳多克隆抗体制备的免疫亲和柱。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先制备了一种母乳多克隆抗体，是以去除脂肪的母乳作为免疫原制备得到。优选免疫剂量1.25mg/只。优选地，抗体溶液在被偏酸性的溶液洗脱后，立即用偏碱性的缓冲液中和，避免抗体在偏酸性的条件下失去活性。优选地，所述偏酸性的溶液为pH2.5-3.5的Glycine洗脱液。更优选地，所述偏酸性的溶液为pH3.0的Glycine洗脱液。优选地，所述偏碱性的缓冲液为pH8-9的Tris-HCI。更优选地，所述偏碱性的缓冲液为pH8.5的Tris-HCI。优选地，纯化后的抗体0-8℃、3000-5000rpm超滤浓缩20-35min，使抗体的浓度提高。更优选地，纯化后的抗体4℃、4000rpm超滤浓缩30min。优选地，所得抗体经过ProteinA/Gagarose纯化。具体地，所述多克隆抗体的制备方法如下：S1.母乳解冻后离心，避开上层乳清部分，吸取下层乳清部分；S2.初次免疫：母乳与弗氏佐剂乳化，乳化的标准是滴一滴液体在液面上，不散开证明乳化完成；S3.后续免疫：等量的抗原与非弗氏完全佐剂混合；S4.第四次免疫后，动脉取血，血清经过ProteinA/Gagarose纯化。优选地，步骤S1所述解冻的温度为0-8℃。更优选地，步骤S1所述解冻的温度为4℃。优选地，步骤S1所述离心的条件为0-8℃下1500-2500g离心10-30min。更优选地，步骤S1所述离心的条件为4℃下2000g离心20min。步骤S2和S3的免疫方法：多点皮下注射，免疫剂量1.25mg/只。步骤S4中纯化的方法如下：全部纯化过程在蛋白纯化仪上操作，将ProteinA/Gagarose装柱，将血清反复过柱后，先用0.15MNaCl，20mMNa2HPO4，pH7.0的缓冲液洗涤，待基线平稳后，抗体溶液再用0.1M的GlycinepH3.0的洗脱液，收集此阶段的出峰液体，然后立即用1MTris-HClpH8.5溶液将抗体调成中性，避免抗体在酸性条件下失活。其中，洗脱抗体的溶液通过超滤管(4℃，4000rpm，30min)经行了一定的浓缩，使IgG的浓度得到一定的提高。另外，基于上述母乳多克隆抗体，构建了一种母乳多克隆抗体免疫亲和柱，其柱中固定的是上述母乳多克隆抗体。通过抗体与抗原的特异性结合，来去除母乳中的高丰度蛋白。优选地，是将所述母乳多克隆抗体与固相配体支持物偶联得到亲和吸附剂，将亲和吸附剂填入柱中制得母乳多克隆抗体免疫亲和柱。填入亲和吸附剂后需经洗涤、封闭、平衡，制得母乳多克隆抗体免疫亲和柱。优选地，所述固相配体支持物为琼脂多糖4B。优选地，所述偶联的步骤如下：S11.把多克隆抗体在偶联缓冲液中进行透析；S12.偶联：将琼脂多糖4B装入层析柱中，先用偶联缓冲液洗去过多的丙酮，然后将抗体加入到层析柱中，过夜；S13.洗涤：用至少5倍琼脂多糖4B体积的偶联缓冲液清洗多余的抗体；S14.封闭：转移到封闭缓冲液中，封闭任何活化的基团；S15.平衡：先用5倍介质体积的0.2mol/LNaHCO3、0.5mol/L的NaCl、pH8.3的缓冲液清洗，再用5倍介质体积的0.1M的乙酸/乙酸钠（pH4.0，包含0.5M的NaCl）洗涤，最后用5倍介质体积的0.1MTris-HCl（pH8.0，包含0.5MNaCl）洗涤；以上循环重复3次；S16.后面紧接着是用0.1MTris-HCl（pH8.0，包含0.5MNaCl）；得到琼脂多糖-抗体偶联复合物的IAC柱。其中优选地，所述偶联缓冲液的成分为：0.1-0.3mol/LNaHCO3、0.4-0.6mol/L的NaCl。更优选地，所述偶联缓冲液的成分为：0.2mol/LNaHCO3、0.5mol/L的NaCl。步骤S12中过夜的条件为4℃、180-220rpm、8-12h。步骤S13洗涤的方法是：静置，待凝胶沉降后，去掉上层的水，再重新倒入偶联缓冲液，如此反复。步骤S14封闭的条件是：转移到封闭缓冲液中后，在4℃过夜或室温放置2h，或者是放置于pH8.0、0.1M的Tris-HCl缓冲液中放置2h。进一步优选地，上述所制得的亲和柱还需经防腐处理。优选地，防腐处理方法是使用1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡。另外，优选地，所得亲和柱的保存温度为1-10℃。优选4℃。最后，本专利技术的亲和柱经过使用后，可经再生处理后进行重复利用。优选地，所述再生处理的方法是：使用后立即用5-10个柱体积的PBS洗涤，最后在用含1/10000叠氮钠的PBS保存，在4℃保存。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了一种母乳多克隆抗体免疫亲和柱及其制备方法。本专利技术制备方法简单，能够更有效地去除母乳中的高丰度蛋白，能够对母乳中丰度相对较低、在质谱中的信号较低的蛋白进行富集，有利于人类更加正确的认识母乳的蛋白轮廓，能应用于母乳蛋白质组学下游的相关技术方面，值得大面积推广和应用。附图说明图1为纯化后抗体的电泳图；1号泳道代表Marker，2号泳道代表未纯化的血清，3号泳道代表纯化后的血清。图2为本专利技术母乳多克隆抗体免疫亲和柱的洗脱高丰度蛋白的结果；1号泳道代表marker，2号泳道母乳样本，3号样本经过免疫亲和柱洗涤下来的样品（去除高丰度蛋白的样本），4号泳道代表免疫亲和柱洗脱下来的样品（高丰度蛋白）；2,3泳道上样量都为5.45µg蛋白。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种母乳多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体是以去除脂肪的母乳作为免疫原制备得到。
【技术特征摘要】
1.一种母乳多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体是以去除脂肪的母乳作为免疫原制备得到。2.根据权利要求1所述多克隆抗体，其特征在于，抗体溶液在被偏酸性的溶液洗脱后，立即用偏碱性的缓冲液中和。3.根据权利要求1所述多克隆抗体，其特征在于，纯化后的抗体0-10℃、3000-5000rpm超滤浓缩20-35min。4.根据权利要求1所述多克隆抗体，其特征在于，所得抗体经过ProteinA/Gagarose纯化。5.一种母乳多克隆抗体免疫亲和柱，其特征在于，所述免疫亲和柱的柱中固定的是权利要求1-4任一所述多克隆抗体。6.根据权利要求5所述母乳多克隆抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳春红，周雄，肖治理，韦晓群，靳登鹏，赖依琳，刘焕，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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