一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，包括以下步骤：(1)设计特异性引物与探针；(2)优化荧光定量PCR反应体系和反应条件；(3)提取含有目的序列的质粒标准品，作为荧光定量PCR阳性模板，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线；(4)提取待测样品的病毒RNA，进行荧光定量PCR扩增，检测所提取病毒是否为传染性肌肉坏死病毒阳性。本发明专利技术以全基因组的5’‑3’的第835个碱基至第901个碱基为目的序列，设计特异性引物和探针，检测灵敏度高、特异性强，且检测结果的重复性高，准确可靠，对操作人员技术要求低，易于实现标准化，尤其适用于出入境对虾的检疫。

A Detection Method of Infectious Muscle Necrosis Virus

The invention discloses a detection method for infectious muscular necrosis virus, which includes the following steps: (1) designing specific primers and probes; (2) optimizing the reaction system and conditions of fluorescence quantitative PCR; (3) extracting plasmid standard materials containing target sequence as positive template of fluorescence quantitative PCR, carrying out fluorescence quantitative PCR amplification, obtaining amplification curve and standard curve; (4) extracting samples to be tested. The viral RNA was amplified by fluorescence quantitative PCR to detect whether the extracted virus was positive for infectious muscle necrosis virus. The invention takes the 835 to 901 bases of the whole genome as the target sequence, designs specific primers and probes, has high sensitivity and specificity, high repeatability, accuracy and reliability of detection results, low technical requirements for operators, easy to achieve standardization, and is especially suitable for the quarantine of entry-exit prawns.

【技术实现步骤摘要】
一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法
本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法。
技术介绍
水产养殖是指在人为控制的条件下繁养、培育并且收获水生动植物的生产活动。病毒性疾病是水产养殖中影响产量的重要因素，密集和多样的养殖方式使得许多病毒有了可乘之机，传染性肌肉坏死病毒(IMNV)就是其中之一，南美白对虾是已知IMNV的最易感虾种，在生长的各个阶段均可被感染。该病第一次于2002年出现于巴西的凡纳滨对虾养殖厂，2006年传入印度尼西亚，感染虾出现体色发白、腹节发红、尾部肌肉组织呈点状或扩散状，体表有不规则黑斑的症状，死亡率在40％～70％不等。IMNV为双链RNA病毒，主要侵染南美白对虾的横纹肌组织，检测手段是发现感染性疾病的方法之一，针对该病毒核酸序列的研究使建立灵敏、特异的检测方法、发展有效的治疗措施成为可能。IMNV病毒核酸为双链不分节段的RNA，不同株的总核苷酸数有些许差别，但大约为8226-8230bp，具有两个不重叠的开放阅读框(ORF)，ORF1编码RNA结合蛋白、主要衣壳蛋白，ORF2编码RNA依赖的RNA聚合酶，是相对保守的区域。截止到目前为止，GenBank中共有该病毒的序列共有18个结果，其中NC-007915与AY570982相同，全基因组序列7个，10个IMNV的部分基因序列。IMNV的检测方法包括免疫学检测方法和以核酸为基础的检测方法，免疫学检测方法的原理是利用特异的抗原抗体反应来检测病毒的方法，不同于病毒的分离培养，免疫学的方法用时短，不需要特定的实验室条件，可以发展为商品化的试剂盒，方便快捷，适合于塘边检测。以核酸为基础的检测方法由于高灵敏度和高特异性的特点，已经广泛用于实验室检测。目前我国尚未报道IMNV感染对虾的案例，但随着经济全球化进程的不断深入，跨境交流越来越频繁，外来疫病的传入的风险也随之扩大，控制风险的主要方式是加强入境动物的检疫，准确、灵敏、重复性好，且易于标准化的检测方法是出入境对虾检疫所迫切需要的。现有IMNV的荧光定量PCR检测方法将研究重点放在灵敏度和特异性上，而忽略了重复性，重复性差导致无法获得准确的检测结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，该检测方法设计特异性引物和探针，检测灵敏度高、特异性强，且检测结果的可重复性高，对操作人员技术要求低，易于实现标准化。本专利技术采用的技术方案如下：一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，包括以下步骤：(1)引物设计：查找GenBank中的传染性肌肉坏死病毒的全基因序列，以全基因组的5’-3’的第835个碱基至第901个碱基为目的序列，使用Primrpremier软件设计特异性引物与TaqMan探针，序列如下，方向5’→3’：正向引物：GAAGCCTAAATACACATCGAC；反向引物：CTGCTTCGCTAAAACCTG；探针：AAAACCGGAGCTGACCAC，5’端用Fam标记，3’端用BHQ-1标记；(2)优化荧光定量PCR反应体系和反应条件；(3)提取含有目的序列的质粒标准品，作为荧光定量PCR阳性模板，进行质粒浓度检测，计算出重组质粒的拷贝数，以10倍稀释度将质粒进行倍比稀释，将其作为标准质粒模板，并设立无模板对照，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线；(4)提取待测样品的病毒RNA，进行荧光定量PCR扩增，检测所提取病毒是否为传染性肌肉坏死病毒阳性。进一步地，步骤(3)中，荧光定量PCR反应体系为：反应总体积25μL，其中ProbeqPCRSuperMix12.5μL、RNaseFreeWater7.5μL、正向引物1μL、反向引物1μL、探针1μL、模板2μL。进一步地，荧光定量PCR的条件为：94℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个循环。进一步地，步骤(4)中，荧光定量PCR反应体系为：反应总体积为25μL，其中2*OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL、TaKaRaExTaqHS0.5μL、PrimeScriptRTEnzymeMIXII0.5μL、正向引物1μL、反向引物1μL、探针0.7μL、ddH206.8μL，模板2μL。进一步地，荧光定量PCR的条件为：42℃预变性5min，95℃变性10s，95℃退火10s，60℃延伸1min，40个循环。进一步地，步骤(3)中，将质粒标准品稀释成108-101拷贝/μL的8个浓度梯度作为标准质粒模板。进一步地，步骤(3)中，采用ddH2O作为无模板对照。进一步地，步骤(3)中，含有目的序列的质粒标准品为：使用步骤(1)中的特异性引物扩增出目的序列，将目的序列连入pUC57-simple载体，然后转化到大肠杆菌中进行扩繁，从大肠杆菌中提取所需含有目的序列的质粒标准品。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术以全基因组的5’-3’的第835个碱基至第901个碱基为目的序列，设计特异性引物和探针，检测灵敏度高、特异性强，且检测结果的重复性高，准确可靠，对操作人员技术要求低，易于实现标准化，尤其适用于出入境对虾的检疫；2、本专利技术在荧光体系中增加逆转录酶，同时实现逆转录和荧光定量PCR扩增，简化操作步骤，提高检测效率。附图说明图1为质粒标准品扩增结果；图2为质粒标准品扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；图3为退火，延伸温度优化结果；图4为引物浓度优化结果；图5为探针浓度优化结果；图6为特异性实验扩增结果(DNA组)；图7为特异性实验扩增结果(RNA组)；图8为灵敏度测定结果；图9为定量标准曲线。具体实施方式本说明书中公开的所有特征，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。使用本专利技术设计的特异性引物扩增出目的序列，将目的序列连入pUC57-simple载体，然后转化到大肠杆菌中进行扩繁，该携带有目的序列质粒的大肠杆菌由华大基因生物技术有限公司合成并提供。实施例1含有目的序列的质粒标准品的提取过程为：将携带有目的序列质粒的大肠杆菌转移至装有5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，置于恒温水浴摇床，37℃震荡16h，250rpm。按照质粒小提试剂盒离心柱型(TIANprepMiniPlasmidKit,DP103，天根)的使用说明提取质粒标准品。柱平衡步骤：吸附柱CP3放入收集管中，向吸附柱中加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取3mLLB液体培养基的菌液加入离心管中，使用台式离心机，12000rpm离心1min，吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL含有RNaseA的溶液P1，使用涡旋振荡器使细菌沉淀彻底悬浮，然后向离心管中加入250μL溶液P2，缓慢地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，翻转步骤在5min之内完成，然后向离心管中加入350μL溶液P3，立刻缓慢地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min，收集上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心50s，倒掉收集管中的废液，重新将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600μL含有无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)引物设计：查找GenBank中的传染性肌肉坏死病毒的全基因序列，以全基因组的5’‑3’的第835个碱基至第901个碱基为目的序列，使用Primr premier软件设计特异性引物与TaqMan探针，序列如下，方向5’→3’：正向引物：GAAGCCTAAATACACATCGAC；反向引物：CTGCTTCGCTAAAACCTG；探针：AAAACCGGAGCTGACCAC，5’端用Fam标记，3’端用BHQ‑1标记；(2)优化荧光定量PCR反应体系和反应条件；(3)提取含有目的序列的质粒标准品，作为荧光定量PCR阳性模板，进行质粒浓度检测，计算出重组质粒的拷贝数，以10倍稀释度将质粒进行倍比稀释，将其作为标准质粒模板，并设立无模板对照，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线；(4)提取待测样品的病毒RNA，进行荧光定量PCR扩增，检测所提取病毒是否为传染性肌肉坏死病毒阳性。

【技术特征摘要】
1.一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)引物设计：查找GenBank中的传染性肌肉坏死病毒的全基因序列，以全基因组的5’-3’的第835个碱基至第901个碱基为目的序列，使用Primrpremier软件设计特异性引物与TaqMan探针，序列如下，方向5’→3’：正向引物：GAAGCCTAAATACACATCGAC；反向引物：CTGCTTCGCTAAAACCTG；探针：AAAACCGGAGCTGACCAC，5’端用Fam标记，3’端用BHQ-1标记；(2)优化荧光定量PCR反应体系和反应条件；(3)提取含有目的序列的质粒标准品，作为荧光定量PCR阳性模板，进行质粒浓度检测，计算出重组质粒的拷贝数，以10倍稀释度将质粒进行倍比稀释，将其作为标准质粒模板，并设立无模板对照，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线；(4)提取待测样品的病毒RNA，进行荧光定量PCR扩增，检测所提取病毒是否为传染性肌肉坏死病毒阳性。2.根据权利要求1所述的一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，荧光定量PCR反应体系为：反应总体积25μL，其中ProbeqPCRSuperMix12.5μL、RNaseFreeWater7.5μL、正向引物1μL、反向引物1μL、探针1μL、模板2μL。3.根据权利要求2所述的一种传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光定量P...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨苗，林华，李建臻，陈世界，方智，张婧，安微，张妙，薛昌华，
申请(专利权)人：四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：四川,51