一种检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的引物、试剂盒及方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术的检测Vesivirus 2117病毒的实时荧光定量PCR引物序列为：正向引物：5′‑ACGTTGACGATAGGGGGAGA‑3′；反向引物：5′‑CTTTGGCAAAGACCCCGTTG‑3′；试剂盒还包括阳性质控品和内参管家基因GAPDH引物序列，其引物序列为：正向引物：5′‑CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA‑3′；反向引物：5′‑TGGTGAAGACGCCAGTAGATT‑3′。本发明专利技术的试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高效率高的特点，且操作简单，节约时间。

A Primer, Kit and Method for Detecting Vesivirus 2117 Contamination in CHO Cells

The invention relates to a primer, a kit and a method for detecting the contamination of Vesivirus 2117 in CHO cells, belonging to the field of biomedical technology. The real-time fluorescence quantitative PCR primer sequence for detection of Vesivirus 2117 virus is as follows: forward primer: 5'ACGTTGACGATAGGGGGGAGA 3'; reverse primer: 5' CTTTGCAAAGACCGTTG 3'; kit also includes positive quality control product and internal reference manager gene GAPDH primer sequence, whose primer sequence is: forward primer: 5'CCGCAGCATTAGCAGCAG 3'; reverse primer: 5'; TGGTGAAGACGCCAGTAGATT 3'. The kit of the invention has the characteristics of high sensitivity, high specificity, high efficiency, simple operation and time saving.

【技术实现步骤摘要】
一种检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及一种检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的引物、试剂盒及方法，属于生物医药

技术介绍
Vesivirus2117属于杯状病毒科，该病毒是生物医药产业细胞培养操作中的污染物之一。杯状病毒科是一个普遍存在的小圆形病毒家族，存在于海洋及某些陆地哺乳动物体内。病毒粒子无包膜，直径为27-40nm，具有二十面体对称性。有些病毒粒子的特征表面有32杯状凹陷的外观，而肠道杯状病毒颗粒缺乏特征表面装饰、外观模糊。Vesiviruses的RNA基因组含有三个主要的开放阅读框(openreadingframes，ORF-1，-2，-3)。ORF-1编码一种蛋白水解的成熟的非结构蛋白。ORF-2编码主要衣壳蛋白VP1，ORF-3编码小结构蛋白VP2。目前，关于Vesivirus2117在细胞培养环境中的生物学特性、致病性和感染范围研究较少。中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)是目前常用的哺乳动物细胞，近70％的重组药物蛋白是由CHO细胞产生的。相比其他重组蛋白生产中使用的细胞系，CHO细胞来源的病毒污染较少，但也有发生，疱疹病毒属2117是目前CHO细胞感染的病毒。被病毒污染的CHO细胞会导致重组蛋白的产量严重降低，进而导致医疗用品供应不足。因此建立Vesivirus2117病毒的快速检测方法，具有十分重要的意义和应用价值。目前对病毒核酸的检测方法较为简便的方法是实时荧光定量PCR，实时荧光定量PCR有荧光染料和荧光探针之分，荧光探针特异性好但成本高，而常用的荧光染料SYBRGreenI因扩增时要求浓度低导致扩增信号较弱，无法解决由于浓度较低造成的染料重分布问题，而且低熔点的cDNA链可能由于染料重分布问题而无法检测到，使其检测的可靠性降低。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种检测Vesivirus2117病毒的实时荧光定量PCR引物。该引物能快速检测CHO细胞是否被Vesivirus2117病毒污染。本专利技术还提供一种检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的试剂盒。该试剂盒的扩增信号强，能解决染料重分布的问题。另外，本专利技术提供一种检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的实时荧光定量PCR方法。该检测方法用时短，通过该方法能快速、准确地检测出CHO细胞是否被Vesivirus2117病毒污染。最后，本专利技术提供一种上述检测Vesivirus2117病毒的实时荧光定量PCR引物、或检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的试剂盒在检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染方面的应用。该引物和试剂盒用于检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染情况，其稳定性好，敏感度高。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种检测Vesivirus2117病毒的实时荧光定量PCR引物，引物序列如下：正向引物：5′-ACGTTGACGATAGGGGGAGA-3′；反向引物：5′-CTTTGGCAAAGACCCCGTTG-3′。该引物是专门针对Vesivirus2117病毒设计的，其特异性强，能高效地检测出Vesivirus2117病毒存在与否。一种检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的试剂盒，包括检测Vesivirus2117病毒的实时荧光定量PCR引物和PCR反应液，引物序列如下：正向引物：5′-ACGTTGACGATAGGGGGAGA-3′；反向引物：5′-CTTTGGCAAAGACCCCGTTG-3′。该试剂盒中包含上述引物，其特异性强，反应效率高。上述PCR反应液包括TaqDNAPolymerase、dNTP、EvaGreen染料和缓冲液。该PCR反应液中的荧光染料EvaGreen对PCR反应的干扰小，能够使用的浓度较高，进而可以增强扩增信号。所述试剂盒还包括阳性质控品和特异性扩增内参CHO细胞管家基因GAPDH的引物；所述阳性质控品含有Vesivirus2117病毒的特异性DNA序列，如SEQIDNO.1所示；所述特异性扩增内参CHO细胞管家基因GAPDH的引物序列如下：正向引物：5′-CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA-3′；反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGATT-3′。该试剂盒中的阳性质控品和内参引物可以判断出检测结果是否有效。一种检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：1)将标准阳性模板配制成系列浓度的溶液，加入特异性引物，分别进行实时荧光定量PCR反应，建立标准曲线；2)提取待测样品基因组RNA，逆转录成cDNA，加入特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，将目的片段的Ct值代入标准曲线，得到待测样品中病毒RNA的拷贝数；所述特异性引物为检测Vesivirus2117病毒的实时荧光定量PCR引物，序列如下：正向引物：5′-ACGTTGACGATAGGGGGAGA-3′；反向引物：5′-CTTTGGCAAAGACCCCGTTG-3′；所述标准阳性模板含目的片段的序列。该检测方法操作简单，灵敏度高，特异性强，能够快速准确地检测出CHO细胞是否被Vesivirus2117病毒污染。步骤1)中实时荧光定量PCR反应的反应体系为：标准阳性模板1μL，25pmol/μL正、反向引物各1μL，10×PCRbuffer5μL，25mmo1/LMg2+4μL，2.5mmo1/LdNTP4.5μL，10×EvaGreen5μL，TaqDNAPolymerase2U，加ddH2O至反应体系总体积为50μL。该反应体系中的EvaGreen实时荧光定量PCR的灵敏度和扩增强度高于普通SYBRGreenI实时荧光定量PCR，可以使反应效率高达90％。步骤1)、步骤2)中实时荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃3min；95℃15s，60℃1min，40个循环；熔解曲线程序为：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃开始收集荧光信号制作熔解曲线。该反应条件下的扩增效率高，产物条带清晰，杂质较少。上述检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的实时荧光定量PCR方法，还包括以下步骤：以阳性质控品为模板，加入特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，如果没有特异性扩增，则步骤2)的检测结果无效；所述阳性质控品含有Vesivirus2117病毒的特异性DNA序列，如SEQIDNO.1所示。阳性质控品检测可以分析扩增病毒的拷贝数定量，确保试剂的可靠性。上述检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的实时荧光定量PCR方法，还包括以下步骤：以待测样品为模板，加入内参CHO细胞管家基因GAPDH特异性引物进行扩增，如果没有特异性扩增，则步骤2)的检测结果无效；所述内参CHO细胞管家基因GAPDH特异性引物序列如下：正向引物：5′-CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA-3′；反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGATT-3′。内参CHO细胞管家基因GAPDH的检测可以验证所提取的待测样品的RNA及逆转录cDNA的质量以及所用试剂盒程序的有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测Vesivirus 2117病毒的实时荧光定量PCR引物，其特征在于：引物序列如下：正向引物：5′‑ACGTTGACGATAGGGGGAGA‑3′；反向引物：5′‑CTTTGGCAAAGACCCCGTTG‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种检测Vesivirus2117病毒的实时荧光定量PCR引物，其特征在于：引物序列如下：正向引物：5′-ACGTTGACGATAGGGGGAGA-3′；反向引物：5′-CTTTGGCAAAGACCCCGTTG-3′。2.一种检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的试剂盒，其特征在于：包括检测Vesivirus2117病毒的实时荧光定量PCR引物和PCR反应液，引物序列如下：正向引物：5′-ACGTTGACGATAGGGGGAGA-3′；反向引物：5′-CTTTGGCAAAGACCCCGTTG-3′。3.根据权利要求2所述的检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液包括TaqDNAPolymerase、dNTP、EvaGreen染料和缓冲液。4.根据权利要求2或3所述的检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性质控品和特异性扩增内参CHO细胞管家基因GAPDH的引物；所述阳性质控品含有Vesivirus2117病毒的特异性DNA序列，如SEQIDNO.1所示；所述特异性扩增内参CHO细胞管家基因GAPDH的引物序列如下：正向引物：5′-CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA-3′；反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGATT-3′。5.一种检测CHO细胞中Vesivirus2117病毒污染的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将标准阳性模板配制成系列浓度的溶液，加入特异性引物，分别进行实时荧光定量PCR反应，建立标准曲线；2)提取待测样品基因组RNA，逆转录成cDNA，加入特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，将目的片段的Ct值代入标准曲线，得到待测样品中病毒RNA的拷贝数；所述特异性引物为检测Vesivirus2117病毒的实时荧光定量PCR引物，序列如下：正向引物：5′-ACGTTGACGATAGGGGGAGA-3′；反向引物：5′-CTTTGGCAAAGACCCCGTTG-3′；所述标准阳性模...

【专利技术属性】
技术研发人员：林重超，王建华，王天云，郭潇，杨献军，王燕芳，
申请(专利权)人：河南普诺易生物制品研究院有限公司，新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41