一种H5亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法技术

本发明专利技术提供一种H5亚型禽流感病毒的实时荧光RT‑PCR检测方法，其中使用的引物对和探针组，其中正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQ ID NO:3。本发明专利技术提供一种基于分子生物学的快速检测H5亚型禽流感病毒的方法，以实现对H5亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。

A Real-time Fluorescence Quantitative RT-PCR Detection Method for H5 Subtype Avian Influenza Virus

The present invention provides a real-time fluorescent RT_PCR detection method for H5 subtype avian influenza virus, in which primer pairs and probe groups are used, in which the sequence of forward primer is SEQ ID NO:1, the sequence of reverse primer is SEQ ID NO:2, and the sequence of probe is SEQ ID NO:3. The invention provides a method for rapid detection of H5 subtype avian influenza virus based on molecular biology, in order to realize the safe, specific, fast, sensitive, simple and high throughput rapid detection of H5 subtype avian influenza virus, thereby making up for the shortcomings of the existing traditional detection technology. This method is very suitable for high-throughput detection. It can simultaneously detect a large number of samples and quickly determine the results. Moreover, TaqMan fluorescent probe is used to avoid pollution and low specificity caused by traditional SYBR Green staining method.

【技术实现步骤摘要】
一种H5亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法
本专利技术属于荧光定量RT-PCR检测
，具体涉及一种H5亚型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR的检测方法，包括鉴定H5亚型流感病毒的引物对和探针。
技术介绍
禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。Perroncito于1878年在意大利首次报道了H5亚型高致病性禽流感。H5亚型禽流感的发生给养禽业造成严重危害。禽流感爆发对中国家禽养殖农户的生计造成了巨大的冲击，农户的家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。H5亚型禽流感病毒还可感染人，可造成人的发病和死亡的公共卫生问题。1997年，我国香港地区首次报道禽流感病毒直接感染人至发病和死亡。此次疫情是高致病性H5N1亚型禽流感病毒首次跨越种属屏障，由家禽感染人类，共计报告18例病例，其中6例死亡。2003年初，香港又再次出现2例人感染H5N1高致病性禽流感个案，其中1例死亡。之后的1年多，人感染H5N1高致病性禽流感病例在东南亚地区多个国家相继出现，包括越南、泰国、中国大陆、柬埔寨。世界卫生组织报道，至2014年全球总共发生感染H5N1禽流感的病例达649例，其中死亡385例，死亡率高达59.32％。我国的H5亚型禽流感病毒近年来变异速率加快，我国主要流行是第7分支、2.3.2.1分支和2.3.4.4分支等，实际应用中需要能够检测所有流行毒株的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种H5亚型禽流感病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，以实现对H5亚型禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。本专利技术首先提供一种检测H5亚型禽流感病毒引物对和探针组，分别是鉴定H5亚型禽流感病毒HA基因的引物对H5forward、H5reverse和探针H5probe，其引物对和探针序列信息如下：正向引物H5forward：5′-ACGTATRACTAYCCGCARTATTCA-3′(SEQIDNO:1)反向引物H5reverse：5′-AGACCAGCYAYCATGATTGCC-3′(SEQIDNO:2)探针H5probe：5′-TCAACAGTGGCGAGYTCCCT-3′(SEQIDNO:3)其中探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。本专利技术再一个方面提供检测临床样品中H5亚型禽流感病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，包括如下的步骤：1)配制荧光定量RT-PCR反应体系反应液每管25μL，含有2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μL，5U/μLTaKaRaExTaqHS0.5μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μL，10pmol/μLH5forward、H5reverse和H5probe各0.5μL，RNaseFreedH2O8.0μL，待检测的样品RNA模板2μL。2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。3)结果判定结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。本专利技术提供一种基于分子生物学的快速检测H5亚型禽流感病毒的方法，以实现对H5亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBRGreen染色法造成的污染和低特异性。附图说明图1：H5亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；图2：本专利技术引物和探针的灵敏度的检测结果图；图3：本专利技术引物和探针的特异性检测结果图。具体实施方式实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：H5亚型禽流感病毒检测引物及探针设计与筛选根据H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)编码基因HA基因进行引物设计，通过NCBI查找到4636条公开的H5亚型禽流感病毒的HA基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于1476-1680的碱基(参考序列GenBank登录号：DQ320884)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物，为提高引物的灵敏度，将上游引物所在区域对应的参考序列第1493位碱基、第1510位碱基和第1521位碱基均设计成简并碱基R，第1515位碱基设计成简并碱基Y；将下游引物所在区域对应的参考序列第1645位碱基和第1647位碱基均设计成简并碱基R。引物序列如下：上游引物H5-F1：5′-ARAAACGGAACGTATRACTACC-3′(22bp)上游引物H5-F2：5′-ACGTATRACTAYCCGCARTATTCA-3′(24bp)下游引物H5-R1：5′-AGACCAGCYACCATGATTGC-3′(22bp)下游引物H5-R2：5′-AGACCAGCYAYCATGATTGCC-3′(23bp)设计2条探针进行最佳探针筛选，为提高探针的灵敏度，将探针序列所在区域对应的参考序列第1623位碱基设计成简并碱基Y。探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。修饰后探针序列如下：H5-P1：5′-HEX-TTCAACAGTGGCGAGYTCCCTAG-BHQ1-3′(23bp)H5-P2：5′-HEX-TCAACAGTGGCGAGYTCCCT-BHQ1-3′(20bp)2对引物和2条探针两两配对形成8个组合进行最佳引物和探针组合筛选。组合1：H5-F1、H5-R1和H5-P1组合2：H5-F1、H5-R2和H5-P1组合3：H5-F2、H5-R1和H5-P1组合4：H5-F2、H5-R2和H5-P1组合5：H5-F1、H5-R1和H5-P2组合6：H5-F1、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测H5亚型禽流感病毒引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对，其正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQ ID NO:3。

【技术特征摘要】
1.一种检测H5亚型禽流感病毒引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对，其正向引物的序列为SEQIDNO:1，反向引物的序列为SEQIDNO:2；探针的序列为SEQIDNO:3。2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。3.权利要求1或2所述的引物对和探针组在制备用于检测H5亚型禽流感病毒的制品中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为实时荧光RT-PCR检测试剂盒。5.一种实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1或2所述的引物对和探针组。6.权利要求1或2所述的引物对和探针组在非疾病和诊断治疗目的检测H5亚型禽流感病毒中的应用。7.一种检测临床样品中H5亚型禽流感病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)配制荧光定量RT-PCR反应体系反应液每管25μL，含有2×OneStepRT-PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王楷宬，王素春，黄保续，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东,37