整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及到生物技术领域，具体涉及整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用，包括如下步骤：pTargetT‑nth/tppB::PtetF4重组质粒的构建；通过整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的单拷贝F4菌毛基因整合克隆株。该益生菌克隆株作为益生菌活疫苗候选株和仔猪断奶后腹泻和水肿病的治疗用药物。相对于现有技术，本发明专利技术的有益效果为：去除Nissle1917益生菌原有质粒，无抗性基因的存在；该重组菌能够有效提高对猪肠道传代上皮细胞的粘附性能；口服免疫小鼠能产生免疫血清，即抗F4菌毛的IgG的抗体；口服免疫后小鼠的血清能显著减低F4

Cloning, Construction and Application of Probiotic Strains Integrating Single-copy Functional F4 Pili Operator Gene

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to probiotic clones, construction methods and applications integrating single-copy functional F4 pili operon genes, including the following steps: construction of pTargetT_nth/tppB:: construction of PtetF4 recombinant plasmid; construction of probiotic clones integrating single-copy functional F4 pili operon genes to obtain resistance-free single-copy F4 pili gene integration. Synclonal strain. The probiotic clone strain was used*as a candidate strain of probiotic live vaccine and as a therapeutic drug for diarrhea and edema after weaning piglets. Compared with the existing technology, the beneficial effect of the invention is: removing the original plasmid of Nissle1917 probiotics and the existence of no resistance gene; the recombinant bacteria can effectively improve the adhesion of the intestinal epithelial cells; the oral immunization mice can produce immune serum, that is, the antibody against F4 pili IgG; the serum of mice after oral immunization can significantly reduce F4.

【技术实现步骤摘要】
整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用
本专利技术涉及到生物技术应用领域，具体涉及到细菌的染色体整合、稳定遗传表达展示外源功能性F4菌毛蛋白。
技术介绍
大肠杆菌Nissle1917是一株无致病性的益生菌，至今并未发现对宿主有已知的不益影响，能给予不同宿主健康益处，且该菌株作为在欧洲上市的名为Mutaflor益生菌产品的主要活性成分，主要用于人类肠道健康调节。在临床应用上，益生菌Nissle1917菌株作为基因工程的载体被加以改造，该益生菌已用于疫苗，肿瘤治疗，保健品，诊断制剂等方面产品的开发与研制。EcNc克隆株为大肠杆菌Nissle1917原型野生株基因改造去除其胞内两个隐秘性质粒pMUT1和pMUT2，具备比亲本株携带更多(大)容量的同源或外源基因的特性，已在申请人实验室制备获得。为了实现微生物中同源或异源蛋白或化合物的过量表达生产，大多利用质粒的过表达，鉴于这种方法易于操作和调控的表达而被广泛使用，但这种方法存在遗传不稳定性。质粒的复制，携带抗生素抗性基因，过量表达以及其他异源基因等问题所带来的代谢负担会导致宿主细胞耗竭，产量损失甚至导致宿主细胞原始功能丧失。此外，为了维持细菌细胞中质粒的存在，须使用抗生素或其他选择性药剂，从而增加了整个生物加工的成本，同时也增加了耐药基因传播的几率。近年来，细菌染色体表达同源或异源基因在合成生物学和生物医学中越来越受青睐。在细菌染色体组整合同源或外源的DNA基因分子，常用的分子生物学方法包括使用转座子、噬菌体、核酸内切酶和重组酶系统，常规的分子生物学方法在细菌染色体整合基因上具有一定的优势，但也都存在着自身的局限性，如长片段基因难以整合，效率低，脱靶率高等。本申请专利所使用的方法为CRISPR/cas9双质粒系统对益生菌Nissle1917无质粒克隆株染色体进行外源大片段DNA基因片段(F4菌毛操纵子基因长约8Kb)的整合。断奶仔猪腹泻(PWD)和仔猪水肿病(ED)为养猪业临床上常见的疾病，主要病原菌为F4和F18菌毛阳性产肠毒素大肠杆菌ETEC，通过菌毛黏附、定植易感仔猪后感染发病，导致仔猪高死亡率，体重降低，生长缓慢，药物治疗费用昂贵等。临床上防治该疾病主要运用抗生素治疗，但随着养殖业生产上耐药菌的产生和累积，急需研究新的防控措施。本专利所构建的多功效益生菌Nissle1917无质粒克隆菌EcNc稳定携带遗传表面表达展示功能性F4菌毛，有望为断奶仔猪腹泻的防控提供新思路和策略。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利申请为利用益生菌Nissle1917无质粒克隆菌EcNc菌株染色体中非必需基因nth/tppB位点单拷贝整合并稳定表达F4(K88)菌毛，有望作为由F4+菌株引起的抗仔猪断奶后腹泻益生菌活性疫苗候选株。为了实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCCNo.16046。整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)pTargetT-nth/tppB::PtetF4重组质粒的构建；2)通过整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的单拷贝F4菌毛基因整合克隆株。步骤1)具体为：所用的引物及含有PAM的N20序列如表2，表3所示。用超高保真DNA聚合酶(Vazyme,P501)进行PCR扩增反应。首先，利用pB032-nth/tppB/pB033扩增引物从pTargetF质粒DNA模板中反向PCR扩增含有靶标位点nth/tppB的N20序列的pTargetF-nth/tppB线性化片段，随后所得的线性化片段利用Ⅱ一步克隆试剂盒(Vazyme,C112)环化PCR产物得到第一环化产物，第一环化产物转化进感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-nth/tppB重组质粒。nth/tppBupsteamHA-F/nth/tppBupsteamHA-R和nth/tppBdownsteamHA-F/nth/tppBdownsteamHA-R扩增引物用来从Nissle1917基因组模板中扩增靶标位点的上游同源臂和下游同源臂。ptetFWD/PtetF4REV-nth/tppB)扩增引物用于从pBR322F4DNA模板中扩增带有Ptet启动子的F4菌毛操纵子基因。IPCRpTargetF-F(HindIII)/IPCRpTargetF-R(PstI)用来线性化pTargetT-nth/tppB质粒。使用MultiS一步克隆试剂盒(Vazyme,C113)将上述四段PCR产物片段分别进行环化得到第二环化产物，包括靶标位点上下游同源臂，含Ptet启动子的F4菌毛操纵子基因片段，线性化的pTargetT-nth/tppB片段。随后转化进感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-nth/tppB::PtetK88系列重组质粒。第二环化产物中，上述四个片段的环化连接排列的顺序为：靶标位点上游同源臂片段、含Ptet启动子的F4菌毛操纵子基因片段、靶标位点下游同源臂片段、线性化的pTargetT-nth/tpp片段。步骤2)具体为：整合重组菌株构建的过程参见附图1注解。pCas质粒电转化进EcNc中构建EcNc/pCas重组菌株。制备EcNc/pCas感受态时,10mM终浓度的L-阿拉伯糖加入其中以助于后期λ-Red同源重组的诱导。取50μl感受态细胞与约100ngpTargetT-nth/tppB::PtetK88系列DNA混合；混合物放于0.1-cm的电极杯(Bio-Rad)中1.8kV进行电转化，点击产物置于1.5ml指形管并加入1ml冰冻的LB培养基孵育约5min，之后于30℃摇床复苏1小时，随后涂布于含卡那霉素(50mg/liter)和壮观霉素(50mg/liter)的LB平板中于30℃培养过夜。挑取抗性平板上生长的可疑阳性克隆株利用菌落PCR鉴定(鉴定引物为YZnth/tppBPtetK88up-F/YZnth/tppBPtetK88up-R和YZnth/tppBPtetK88down-F/YZnth/tppBPtetK88down-R，上述两对引物PCR结果若有阳性条带，则证明整合成功；外加一对鉴定引物，YZnth/tppBPtetK88up-F/YZnth/tppBPtetK88down-R，该引物PCR产物若只有约600bp，则证明整合失败，若出现大于8000bp的条带，则证明整合成功)，随后选取阳性整合重组菌株送测序再次鉴定。在获得阳性单拷贝F4整合株后，进一步去除抗性质粒。将含有pCas和pTargetT-nth/tppB::PtetK88质粒的EcNc菌株至于约5ml含卡那霉素(50mg/liter)和IPTG(0.5mM)的LB培养基中30℃摇床中培养14-18小时，之后挑取少许菌液于含卡那霉素(50mg/liter)的LB平板上划线，长出的单菌落于壮观霉素(50mg/liter)LB平板上划线以验证其对壮观霉素的敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCC No.16046。

【技术特征摘要】
1.整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCCNo.16046。2.整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：pTargetT-nth/tppB::PtetF4重组质粒的构建；通过整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因表达展示在益生菌克隆株菌体表面，得到无抗性的单拷贝F4菌毛基因整合克隆株。3.根据权利要求2所述的整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建方法，其特征在于，步骤2）具体为：pCas质粒电转化入益生菌EcNc中以构建EcNc/pCas重组菌株；制备EcNc/pCas感受态，取EcNc/pCas感受态细胞与pTargetT-nth/tppB::PtetF4重组质粒混合，对感受态细胞和pTargetT-nth/tppB::PtetF4重组质粒组成的混合物进行电转化，电击产物置于冰冻的LB培养基孵育，之后于30℃摇床复苏，涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB平板中于30°C培养过夜；挑取抗性平板上生长的可疑阳性克隆株病利用菌落PCR鉴定，若出现大于8000bp的条带，则证明整合成功，测序并确定是否获得了阳性单拷贝F4整合株；再去除抗性质粒，最终得到无抗性的单拷贝F4菌毛基因整合克隆株。4.根据权利要求2所述的整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建方法，其特征在于，去除抗性质粒的步骤为：将含有pCas和pTargetT-nth/tppB::PtetF4质粒的EcNc菌株置于含卡那霉素和0.5mMIPTG的LB培养基中30℃摇床中培养14-18小时，之后挑取少许菌液于含卡那霉素的LB平板上划线，长出的单菌落于含壮观霉素的LB平板上划线以验证其对壮观霉素的敏感性，以验证是否去除了pTargetT-nth/tppB::PtetF4质粒；去除pTargetT-nth/tppB::PtetF4质粒后，再进行另外一个质粒pCas的去除，将该EcNc菌株置于无抗性的LB培养基中于42℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国强，区炳明，金铎，夏芃芃，朱军，徐梦娴，宋浩亮，梁轩，杨颖，朱晓芳，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32