一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物、试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物、试剂盒及其方法。本发明专利技术的试剂盒中包含该组合物，组合物是由特定序列的引物组和探针组组成；本发明专利技术通过设计的引物组合探针组，对样本中的HBV DNA进行荧光实时定量PCR实现HBV的B、C、D三种基因分型检测。本发明专利技术的乙型肝炎病毒基因分型检测组合物和试剂盒操作简单、交叉反应少、成本低、灵敏度高、分型准确度高。

Composition, kit and method for genotyping of hepatitis B virus

The invention discloses a composition, a kit and a method for detecting hepatitis B virus genotyping. The kit of the invention contains the composition, which is composed of primers and probes of specific sequence. The method realizes the detection of B, C and D genotypes of HBV by real-time fluorescence quantitative PCR of HBV DNA in samples through the designed primer combination probes. The composition and kit for hepatitis B virus genotyping detection of the invention have the advantages of simple operation, less cross reaction, low cost, high sensitivity and high typing accuracy.

【技术实现步骤摘要】
一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物、试剂盒及其方法
本专利技术涉及医学检验领域，具体涉及一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物、试剂盒及其方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)作为一种累积感染全球20亿以上人口的病原体，严重危害着受感染人群的肝健康，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)。HBV属嗜肝DNA病毒科(Hepandnaviridae)，其基因组为双链DNA，呈不完全闭合环状。依据HBV全基因序列核苷酸异源性≥8％，或S基因异源性≥4％这一原则，将HBV分为A～I型9种基因型。该9种不同的基因型在全球范围内呈差异性地域分布，在我国主要以B、C基因型及少量D基因型为主。HBV研究的早期，主要采用血清亚型区分不同HBV毒株；随分子生物学研究的发展，相比血清亚型，HBV基因分型被发现能更准确地反映不同病毒株之间的异源性，且不同基因型的HBV的致病机理不同，导致不同基因型感染所致的乙型肝炎的病情进展、临床症状、预后、治疗方案及治疗效果都有所差异。例如，不同基因型HBV对病情进展和干扰素抗病毒治疗的效果不同，B基因型感染者比C基因型感染者更早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌；而在HBeAg阳性患者中，B基因型感染者对干扰素抗病毒治疗的应答率高于C基因型感染者，A基因型感染者的应答率高于D基因型感染者。HBV全基因组长约3.2Kb，对其全基因组进行测序是HBV基因分型的金标准，该方法结果可靠、直接，但耗时长，且费用偏高，不适宜广泛开展，故依据S基因核苷酸异源性≥4、同源性<96％的标准对S基因测序结果进行分型演变为简化版本的HBV测序分基因型的方法，但费用高、费时的固有缺点仍然无法避免。其他临床上用于HBV基因分型的方法还包括限制性片段长度多态性分析(RFLP)、线性探针杂交检测、反向杂交法、基因芯片、荧光PCR等多种方法，其中荧光PCR法无需对扩增产物进行开盖处理，避免了诸多方法中杂交步骤所可能造成的污染的风险，且荧光PCR法可避免测序分型法对不同基因型混合感染漏检的情况。荧光PCR法虽简便快捷，但目前临床所用的荧光PCR分型检测产品通常需进行至少2管PCR检测才能区分3种或3种以上HBV基因型，又或者现有的乙肝病毒荧光PCR分型检测产品灵敏度不高、准确性差。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物、试剂盒及其方法。一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物，其特征在于：该组合物包括引物组和探针组；所述引物组包括：引物1：其具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物2：其具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，引物3：其具有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，引物4：其具有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，引物5：其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，引物6：其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；所述探针组包括：探针B：其具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探针C：其具有如SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，探针D：其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列。本专利技术一个优选实施方案中，所述探针组中的探针分别标记不同的荧光发光基团。更优选地，所述荧光发光基团选自最大发射波长为518nm、538～555nm、574～575nm、602～615nm、640nm、660～667nm或690nm的荧光发光基团。本专利技术另一个优选实施方案中，所述荧光发光基团为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine6G、OrengonGreen488、OrengonGreen500、OrengonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、ROX或VIC。在一种实施方式中，上述组合物应用于制备用于乙型肝炎病毒基因分型检测的试剂盒。在另一种实施方式中，一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒含有上述用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物。本专利技术一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液和添加剂；所述添加剂为海藻糖和甲酰胺。本专利技术另一个优选实施方案中，所述添加剂是由1M海藻糖和甲酰胺按体积比为1.3:0.8混合而成的混合物。在另一种实施方式中，一种乙型肝炎病毒基因分型检测的方法，该方法的PCR反应体系为：所述引物组包括：引物1：其具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物2：其具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，引物3：其具有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，引物4：其具有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，引物5：其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，引物6：其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；所述探针组包括：探针B：其具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探针C：其具有如SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，探针D：其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列。本专利技术一个优选实施方案中，该反应体系还包括2.1μL的添加剂。本专利技术更进一步的优选实施方案中，所述添加剂为1M海藻糖和甲酰胺按体积比为1.3:0.8混合而成的混合物。下面将详细地解释本专利技术。基于HBV在我国的地理分布特点呈南方以B基因型为主，北方以C基因型为主，D基因型多分布在新疆、西藏、宁夏等少数民族聚集地，其他基因型鲜有发现的特点，本专利技术设计了靶向B、C、D基因型的核苷酸特异探针，建立了利用扩增曲线和Ct值检测HBV基因型的荧光PCR方法。本专利技术提供了一种用于区分HBV的B、C、D三种基因的检测组合物、试剂盒及方法。本专利技术从美国国立卫生研究院(NIH)的基因序列数据库(GenBank)中下载HBV的B、C、D全基因组序列，用欧洲生物信息研究所(EML-EBI)的序列比对软件(MUSCLE)对上述已下载的已分型的基因组序列进行比对分析，根据分析结果选定引物探针设计区域，然后按照引物探针的设计原则，利用PrimerPremier5.0和PrimerExpress3.0软件协同进行引物探针的设计，上下游引物和探针均设计在含有特异性碱基的序列区域。本专利技术设计的引物扩增出的扩增片段通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Primer-BLAST验证扩增片段确为HBV的目的基因型。本专利技术的检测方法和检测试剂盒是针对提取血清样本中的DNA进行的检测，在进行PCR反应体系配制时，加入血清DNA，在荧光PCR仪中运行三重荧光PCR程序，扩增目的片段，根据扩增曲线和Ct值判断基因型，实现对HBV的分型。本专利技术优选在探针B的5’端标记CY5荧光基团，探针C的5‘端标记VIC荧光基团，探针D的5’端标记FAM荧光基团，B、C、D基因型的探针3’端均标记淬灭基团。本专利技术的PCR反应体系具体为：10×PCRBuffer4μL，10μMB基因型上游引物、10μMB基因型下游引物、10μMC基因型上游引物、10μMC基因型下游引物、10μMD基因型上游引物、10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物，其特征在于：该组合物包括引物组和探针组；所述引物组包括：引物1：其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，引物2：其具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，引物3：其具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，引物4：其具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，引物5：其具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，引物6：其具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；所述探针组包括：探针B：其具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针C：其具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，探针D：其具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物，其特征在于：该组合物包括引物组和探针组；所述引物组包括：引物1：其具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，引物2：其具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，引物3：其具有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，引物4：其具有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，引物5：其具有如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，引物6：其具有如SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；所述探针组包括：探针B：其具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，探针C：其具有如SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，探针D：其具有如SEQIDNO.9所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物，其特征在于：所述探针组中的探针分别标记不同的荧光发光基团。3.根据权利要求2所述的用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物，其特征在于：所述荧光发光基团为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine6G、OrengonGreen488、OrengonGreen500、OrengonG...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨了寒，杨文秀，龙腾骧，
申请(专利权)人：迈克生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51