一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于酶工程领域。本发明专利技术是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)作为表达宿主，通过表达来源于链霉菌(Streptomyces racemochromogenes)的磷脂酶D编码基因(PLD)，得到了产磷脂酶D的枯草芽孢杆菌基因工程菌，在前期构建质粒的基础上在250mL摇瓶上通过启动子优化，成功使酶活从26.3U/mL，提高到34.7U/mL，并将发酵周期缩短到了24h。通过质粒稳定性检测，在传代5次后，质粒持有率依然达到100％，在200L罐上放大生产，酶活比摇瓶培养提高近5倍，达到171.5U/mL，可用于磷脂酶的工业化生产及转酯产物磷酯酰丝氨酸的生成。

A Recombinant Bacillus subtilis Producing Phospholipase D and Its Application

The invention discloses a recombinant Bacillus subtilis producing phospholipase D and its application, which belongs to the field of enzyme engineering. The present invention is based on Bacillus subtilis WB600 as expression host. By expressing phospholipase D coding gene (PLD) derived from Streptomyces racemochromogenes, the genetic engineering strain of Bacillus subtilis producing phospholipase D is obtained. On the basis of the previous construction of plasmid, the enzyme activity is improved from 26.3U/mL through promoter optimization on 250mL shaker. To 34.7U/mL, the fermentation period was shortened to 24h. After five passages, the plasmid holdup rate was still 100%. The enzymatic activity was nearly five times higher than that of shaking flask culture, reaching 171.5U/mL. It can be used for industrialized production of phospholipase and production of phosphatidylserine, a transesterification product.

【技术实现步骤摘要】
一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于酶工程

技术介绍
磷脂酶D(PLD)属于磷脂酰二酯合成酶类，具有该家族的明显特征，即含有两个间隔出现的H(x)K(x)4D(H代表组氨酸；K代表赖氨酸；D代表天冬氨酸；X代表任意氨基酸)保守序列。磷脂酶D可以催化底物相中的磷脂类物质和水相中的亲核供体发生类似于酯缩合的转酯反应，是合成磷酯酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等稀有磷脂的良好工具酶之一。利用该酶的高度专一性，对现有来源广泛的粗品磷脂进行转化和改性，可以制备一些稀有磷脂，在医药及食品保健品领域具有很大的应用价值。目前，磷脂酶D主要通过从大豆等植物或动物脑中分离提取得到，生产成本高，环境污染代价大，售价昂贵，不能满足市场需求。而现有的通过微生物法构建基因工程菌来发酵生产磷脂酶D的方法，结果都不理想。在大肠杆菌、毕赤酵母、解脂耶氏酵母及链霉菌中异源表达磷脂酶D均出现过报道，但均存在一定的缺陷。如在大肠杆菌中磷脂酶D蛋白易形成包涵体，且磷脂酶D对大肠杆菌的生长有抑制作用，导致分泌量很低；酵母为真核生物，发酵周期通常较长，如张莹等以毕赤酵母为宿主时，获得的重组磷脂酶D酶活仅为1U/mL，且发酵时间长达3天(张莹.在不同宿主中表达链霉菌磷脂酶D的研究[D].华东理工大学,2013)，且在酵母中磷脂酶D的酶活和蛋白表达量均不显著，并不适用于工业化生产；链霉菌的克隆表达系统已经比较成熟，但相比于原核表达系统，外源基因的引入相对复杂，部分链霉菌还存在一定的限制修饰系统，会导致转化率过低，且链霉菌生长过程较为复杂且易发生遗传突变，成熟的表达系统数量也有限，以上瓶颈限制了链霉菌表达系统的广泛应用。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别，且具有清晰的生理和遗传背景，我们尝试以枯草芽孢杆菌为表达宿主来表达磷脂酶D。但是，链霉菌属于放线菌目的一科，枯草芽孢杆菌则属于芽孢杆菌属的一种，两者属于不同的菌种，遗传上可能存在一些隔阂，导致链霉菌来源的目的基因可能并不能被枯草所识别，在枯草芽孢杆菌中表达磷脂酶D存在一定的难点。另外，采用枯草芽孢杆菌进行磷脂酶D的工业化生产，若能够成功获得胞外酶，可直接将发酵上清液添加到底物中进行产物磷脂酰丝氨酸(PS)的生产。但是，PS多添加在奶粉，保健品等食品中，因而对抗生素的残留有严格限制。发酵过程中为了防止质粒丢失，通常会在接种时添加一定浓度的抗生素，导致有一部分抗生素残留到产品中。因此，质粒的稳定性尤为重要。因此，提供一种成本低、环保、可溶性表达量高且质粒稳定性高的产磷脂酶D的基因工程菌，对于工业生产磷脂酶D具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌，将如下DNA片段融合后表达：SpoVG启动子、RBS及spacer区、amyE信号肽、与来源于链霉菌(Streptomycesracemochromogenes)10-3的磷脂酶D基因；所述SpoVG启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述RBS及spacer区的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述amyE信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷脂酶D基因的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。在本专利技术的一种实施方式中，以pP43NMK、pSTOP1622或pMA系列载体为表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，以BacillussubtilisWB600为宿主。本专利技术的第二个目的是提供上述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，将如下DNA片段融合后表达：SpoVG启动子、amyE信号肽、RBS及spacer区与来源于链霉菌(Streptomycesracemochromogenes)10-3的磷脂酶D基因；所述SpoVG启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述RBS及spacer区的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述amyE信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；将融合后的基因连接到表达载体上，转入枯草芽孢杆菌中表达。本专利技术的第三个目的是提供一种生产磷脂酶D的方法，是应用上述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵。在本专利技术的一种实施方式中，将35-38℃、200-220rpm条件下培养5-10h的重组枯草芽孢杆菌以1-10％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、200-220rpm条件下发酵20-28h。在本专利技术的一种实施方式中，将35-38℃、200-220rpm条件下培养5-10h的重组菌，接入装液量30-40％的200L发酵罐，以氨水控制pH为6-7，培养温度35-38℃，溶氧控制在20-40％左右，发酵过程中通过流加糖控制在0.3-0.7％，通气比1:0.5-1:1vvm，罐压控制在0.5-1pa。本专利技术的第四个目的是提供上述的重组枯草芽孢杆菌在制备磷酯酰丝氨酸或磷脂酰肌醇中的应用。本专利技术的第五个目的是提供上述的重组枯草芽孢杆菌在食品、保健品或制药领域内的应用。本专利技术通过对重组质粒上的启动子进行优化，成功使链霉菌来源的磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中的胞外异源分泌表达量从26.3U/mL提高到34.7U/mL，并将发酵周期缩短到24h，通过质粒稳定性检测，在传代5次后，质粒持有率依然达到100％，避免了因为后期抗生素的添加，而出现质粒大量丢失的情况。在200L罐上放大生产，酶活比摇瓶培养提高近5倍，达到171.5U/mL，可用于磷脂酶的工业化生产及转酯产物磷酯酰丝氨酸的生成。采用枯草芽孢杆菌作为宿主菌产磷脂酶D，发酵工艺简单，周期较短，且避免酶形成包涵体，有很大的应用前景。附图说明图1：pP43-lytR-PLD构建过程示意图。图2：质粒图谱。图3：不同启动子构建的重组菌的酶活测定结果，对照为含出发质粒的重组菌。图4：第5次传代后，抗性平板和无抗平板上重组菌生长情况。图5：200L罐上不同时期酶活测定结果。具体实施方式(一)实验材料和试剂1、菌株与载体枯草芽孢杆菌WB600，枯草芽孢杆菌168，商业化载体pP43NMK。2、酶与试剂盒高保真primeSTARMaxDNA扩增酶、限制性内切酶购自Takara公司，质粒提取、胶回收试剂盒购自上海生工。(二)培养基250mL摇瓶种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。发酵培养基(g/L)：甘油15，胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸二氢钾2.31，三水磷酸氢二钾16.42。200L罐上种子罐培养基为葡萄糖1％，酵母浸粉0.5％，骨蛋白胨1％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钠0.2％，消泡剂0.02％。发酵罐培养基：葡萄糖1％，酵母浸粉1.5％，骨蛋白胨3％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钠0.2％，消泡剂0.02％。(三)酶活测定方法：100μL反应液1：0.5％(w/v)蛋黄卵磷脂，0.1％(w/v)曲拉通X-100，40mMTris-HCl(pH7.4)，2μL酶液(50×)，37℃反应10min。50μL反应终止液：50MEDTA，200MTris-HCl(pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将如下DNA片段融合后表达：SpoVG启动子、RBS及spacer区amyE信号肽、与来源于链霉菌(Streptomyces racemochromogenes)10‑3的磷脂酶D基因；所述SpoVG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述RBS及spacer区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述amyE信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

【技术特征摘要】
1.一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将如下DNA片段融合后表达：SpoVG启动子、RBS及spacer区amyE信号肽、与来源于链霉菌(Streptomycesracemochromogenes)10-3的磷脂酶D基因；所述SpoVG启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述RBS及spacer区的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述amyE信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述磷脂酶D基因的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。3.如权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以pP43NMK、pSTOP1622或pMA系列载体为表达载体。4.如权利要求1-3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以BacillussubtilisWB600为宿主。5.权利要求1-4任一所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，将如下DNA片段融合后表达：SpoVG启动子、amyE信号肽、RBS及spacer区与来源于链霉菌(Streptomycesracemochromogenes)10-3的磷脂酶D基因；所述S...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，李江华，黄婷婷，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32