一种抗菌肽、抗菌肽水凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物制药技术领域，特别涉及一种抗菌肽、抗菌肽水凝胶及其制备方法。本发明专利技术所述抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验表明本发明专利技术所述多肽具有较高的抗菌活性和优异的生物相容性。本发明专利技术所述抗菌肽水凝胶由抗菌肽、光热试剂和伤口促生长因子制成。试验表明，所述抗菌肽水凝胶对生物膜表面的细菌尤其是耐药细菌具有很好的杀伤作用，能够有效裂解、清除细菌生物膜，促进伤口表皮细胞的生长增殖、胶原形成和血管的新生，实现细菌生物膜感染伤口的快速愈合。

A Hydrogel of Antimicrobial Peptide and Antimicrobial Peptide and Its Preparation Method

The invention relates to the field of biopharmaceutical technology, in particular to an antimicrobial peptide, an antimicrobial peptide hydrogel and a preparation method thereof. The amino acid sequence of the antimicrobial peptide of the invention is shown as SEQ ID NO:1. The experiment shows that the polypeptide has high antimicrobial activity and excellent biocompatibility. The antimicrobial peptide hydrogel is made of antimicrobial peptide, photothermal reagent and wound growth factor. Experiments show that the antimicrobial peptide hydrogel has good killing effect on bacteria on the surface of biofilm, especially drug-resistant bacteria. It can effectively crack and remove bacterial biofilm, promote the growth and proliferation of wound epidermal cells, collagen formation and angiogenesis, and realize the rapid healing of wounds infected by bacterial biofilm.

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽、抗菌肽水凝胶及其制备方法
本专利技术涉及生物制药
，尤其涉及一种抗菌肽、抗菌肽水凝胶及其制备方法。
技术介绍
人体皮肤受伤后，正常的组织愈合会经历止血、炎症、增生和组织重塑等过程。伤口的这一系列愈合过程不仅复杂，而且脆弱，容易受到各种因素的干扰而停滞，从而形成慢性伤口。慢性伤口感染构成了人类感染性疾病的60～80％，另外随着社会人口老龄化和糖尿病、肥胖等疾病患病率的不断增加，慢性伤口已经成为全球卫生健康的主要问题之一。在慢性伤口中，细菌生物膜感染是比较常见的一种情况。细菌生物膜是指细菌为了适应生存环境黏附于机体组织表面形成的，由细菌和它所分泌的胞外聚合物(多糖、蛋白质、核酸等)组成的膜状细菌群体。与处在浮游状态的细菌相比，生物膜中细菌的耐药性更强，且可以逃避宿主免疫系统的攻击，导致感染迁延不愈，另外细菌还可自生物膜处向外散播，引发其他部位的感染。对细菌生物膜感染伤口的不恰当治疗往往会造成身体的截肢，因此开发细菌生物膜感染伤口的治疗方法具有重要的研究价值。目前治疗细菌生物膜感染伤口的方法主要分为两大类：机械清创与抗菌药物治疗。机械清创指通过手术的方式来对感染伤口的创面进行深部处理，来实现清除细菌生物膜的目的。抗菌药物治疗是指通过在伤口处添加抗菌药物，来实现对细菌生物膜的杀伤。常用的抗菌药物主要有纳米银制剂、抗生素及抗菌肽等。其中，纳米银主要靠释放银离子来杀灭细菌；抗生素主要依靠结合到细菌细胞壁上，并通过阻止细菌的代谢途径来杀菌；抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，通过破坏细菌的细胞膜结构来实现杀菌的目的。然而上述方法均有各自的缺点，其中，机械清创无法完全去除生物膜，而任何残留都会使生物膜很快恢复；由于生物膜的多重耐药机制，抗生素很难实现对细菌生物膜完全杀伤；纳米银制剂和现有的抗菌肽(如防御素)在杀灭细菌的同时，也会对正常组织产生无法忽视的毒性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种抗菌活性高、细胞毒性小的一种抗菌肽、抗菌肽水凝胶及其制备方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。在一些实施方案中，所述抗菌肽氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，命名为抗菌肽1。在一些实施方案中，所述抗菌肽氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，命名为抗菌肽2。本专利技术采用固相合成法制备抗菌肽1，其氨基酸序列为：(氨基端)Ile-Lys-Tyr-Leu-Ser-Val-Asn(羧基端)，在合成过程中，首先将Fmoc-天冬酰胺的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂(作为固相载体)相连，然后经过脱保护将天冬酰胺的氨基与Fmoc-缬氨酸的羧基经过缩合形成肽键，重复上述肽键的形成反应，逐步将丝氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸及异亮氨酸连接到树脂上，使肽链从羧基端向氨基端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后用氢氟酸将肽链从树脂上切割下来，得到抗菌肽1。本专利技术采用固相合成法制备抗菌肽2，其氨基酸序列为：(氨基端)Ile-Lys-Phe-Leu-Ser-Val-Asn(羧基端)。在合成过程中，首先将Fmoc-天冬酰胺的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂(作为固相载体)相连，然后经过脱保护将天冬酰胺的氨基与Fmoc-缬氨酸的羧基经过缩合形成肽键，重复上述肽键的形成反应，逐步将丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸及异亮氨酸连接到树脂上，使肽链从羧基端向氨基端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后用氢氟酸将肽链从树脂上切割下来，得到抗菌肽2。本专利技术考察了抗菌肽1和抗菌肽2的抗菌活性和细胞毒性，结果发现，抗菌肽1和抗菌肽2具有较高的抗菌活性，且对正常细胞生长基本没有影响，具有优异的生物相容性。本专利技术研究发现，所述抗菌肽在中性(pH＝7左右)条件下能自组装成具有三维网状结构的水凝胶，用于保持伤口局部湿润，保护新生肉芽组织不受损伤，同时对生物膜表面的细菌进行有效杀伤；另一方面，此水凝胶在弱酸性(pH＝5.5左右)条件下，会发生一定程度的解聚，因此可作为一种pH响应性负载药物的载体。因此，本专利技术还提供了所述抗菌肽在制备治疗和/或预防细菌生物膜感染的药物中的应用。本专利技术还提供了一种抗菌肽水凝胶，由所述抗菌肽、光热试剂和伤口促生长因子制成。其中，所述抗菌肽、光热试剂和伤口促生长因子共同形成水凝胶。本专利技术所述抗菌肽水凝胶装载了两类药物，一类为光热试剂，通过光热效应实现对细菌生物膜的裂解和清除；另一类药物为伤口促生长因子，用于促进伤口表皮细胞的生长增殖、胶原形成和血管的新生。本专利技术所述抗菌肽水凝胶中，抗菌肽在中性(pH＝7左右)条件下能自组装成具有三维网状结构的水凝胶，用于保持伤口局部湿润，保护新生肉芽组织不受损伤，同时对生物膜表面的细菌进行有效杀伤；另一方面，抗菌肽水凝胶在伤口细菌生物膜感染的微酸环境下可释放出所转载的光热试剂和伤口促生长因子，从而实现对细菌生物膜的裂解和清除，同时大幅度促进伤口表皮细胞的生长增殖、胶原形成和血管的新生，最终实现细菌生物膜感染伤口的快速愈合。在一些实施方案中，所述抗菌肽与光热试剂的质量比为100:1～200:1，抗菌肽与伤口促生长因子的质量比为0.8:1～1:1。在一些具体实施例中，所述抗菌肽与光热试剂的质量比为200:1，抗菌肽与伤口促生长因子的质量比为0.8:1。在一些实施方案中，所述伤口促生长因子为脯氨酸、成纤维细胞生长因子或表皮生长因子。在一些具体实施例中，所述伤口促生长因子为脯氨酸。在一些实施方案中，所述光热试剂为普鲁士蓝、吲哚菁绿或其羧基衍生物Cypate。在一些具体实施例中，所述光热试剂为吲哚菁绿。本专利技术还提供了所述抗菌肽水凝胶的制备方法，具体为：向所述抗菌肽中加入溶解有光热试剂和伤口促生长因子的水溶液，超声至抗菌肽溶解充分，得多肽混合液，静置，自组装形成抗菌肽水凝胶。多肽混合液静置≥10min即可自组装形成水凝胶。本专利技术提供的抗菌肽水凝胶在使用时，先将水凝胶涂覆到伤口表面，然后用近红外激光器(功率为1～2W/cm2)对伤口加以照射一定时间(5～10分钟)，以实现对伤口细菌生物膜的裂解清除，促进伤口快速愈合。本专利技术提供一种抗菌肽、抗菌肽水凝胶及其制备方法。本专利技术所述抗菌肽氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。实验表明本专利技术所述多肽具有较高的抗菌活性和优异的生物相容性。本专利技术所述抗菌肽水凝胶由抗菌肽、光热试剂和伤口促生长因子制成。试验表明，所述抗菌肽水凝胶对生物膜表面的细菌尤其是耐药细菌具有很好的杀伤作用，能够有效裂解、清除细菌生物膜，促进伤口表皮细胞的生长增殖、胶原形成和血管的新生，实现细菌生物膜感染伤口的快速愈合。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示抗菌肽1，抗菌肽2及防御素的抗菌曲线图；图2示抗菌肽1，抗菌肽2及防御素对细胞活性的影响图；图3示抗菌肽1制备的水凝胶及其电镜图；图4示抗菌肽1水凝胶中光热试剂(ICG)在不同pH下的释放效率图；图5示抗菌肽1水凝胶中伤口促生长因子(脯氨酸)在不同pH下的释放效率图；图6示耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜经过处理后的结晶紫染色结果图，其中，图6A为抗菌肽1水凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求1所述抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。4.权利要求1～3任一项所述抗菌肽在制备治疗和/或预防细菌生物膜感染的药物中的应用。5.一种抗菌肽水凝胶，其特征在于，由权利要求1～3任一项所述抗菌肽、光热试剂和伤口促生长因子制成。6.根据权利要求5所述抗菌肽水凝胶，其特征在于，所述抗菌肽与光热试剂的质量比为100:1～200:1，抗菌肽与伤口促生长因子的质量比为0.8:1～1:1。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永强，王建浩，赵远，杜炫呈，吴春，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32