一种用于糖尿病溃疡的修复材料及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于糖尿病溃疡的细胞外基质修饰的修复材料，它是人尿源性干细胞细胞外基质修饰的小肠黏膜下层膜。本发明专利技术修复材料具有良好的生物相容性和生物活性，不仅最大限度去除免疫原性，减少炎性期持续时间；又保留细胞外基质及基质中的生长因子，促进糖尿病皮肤溃疡创面愈合，同时本发明专利技术使用的细胞及材料来源广泛，制备过程中不会造成患者的二次伤害。克服了现有糖尿病溃疡修复材料细胞来源有限、难以存活，材料制备过程复杂、形成二次创伤、免疫原性强，创面易发生感染的缺点，具有良好的临床应用前景。

A repair material for diabetic ulcer and its preparation method

The invention discloses an extracellular matrix modified repair material for diabetic ulcer, which is a small intestinal submucosa membrane modified by extracellular matrix of human urinary stem cells. The repairing material of the invention has good biocompatibility and biological activity, not only removes the immunogenicity to the greatest extent and reduces the duration of inflammatory period, but also retains the growth factors in the extracellular matrix and matrix to promote wound healing of diabetic skin ulcer. At the same time, the cells and materials used in the invention have a wide range of sources and will not cause secondary injury to patients in the preparation process. It overcomes the shortcomings of the existing materials for repairing diabetic ulcer, such as limited cell source, difficult survival, complex preparation process, secondary trauma, strong immunogenicity and easy infection of wound surface, and has a good clinical application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种用于糖尿病溃疡的修复材料及其制备方法
本专利技术涉及一种用于糖尿病溃疡的细胞外基质修饰的修复材料及其制备方法。
技术介绍
近年来糖尿病的发病率逐渐上升，截至2015年，全球范围内，每11名成年人中就有1人患有糖尿病(总计4.15亿)；有3.18亿糖尿病前期患者，糖尿病患病率高达8.8％，糖尿病前期的患病率有6.7％。糖尿病皮肤溃疡是糖尿病一种难治性并发症，且每位糖尿病患者在其生命周期中发生溃疡的概率高达15％。糖尿病皮肤溃疡创面因易感染、生长因子失活或分布异常、局部血流量下降和缺氧等，导致创面愈合时间延长，甚至不愈合而致残或截肢。针对该并发症，烧伤整形科、皮肤科、骨科、内分泌科等科室都进行了广泛的研究，目前主要采用内科积极控制血糖的同时结合必需的外科治疗。外科治疗中，临床上多采用皮瓣和全厚皮片移植，但存在的问题是：皮瓣难以存活，以及术后创面易发生感染；更为严重的是皮瓣和全厚皮片的获取形成的二次创伤，给患者带来更大的创伤和风险。随着组织工程和再生医学不断发展，利用组织工程技术制备治疗糖尿病皮肤溃疡修复材料的研究很多，目前研究中的治疗手段有：运用组织工程全层皮肤、ADSCs、BMSCs促进糖尿病皮肤溃疡修复等，这些实验研究中的治疗手段都不同程度地促进了糖尿病溃疡创面的愈合。但是这些研究或多或少存在着缺陷，如：细胞来源有限、细胞获取有创、材料制作过程复杂和材料免疫原性强等。OasisUltra三层基质为治疗糖尿病足溃疡的产品，其为一种新型的细胞外基质修饰的三层猪小肠黏膜下层，相对于之前的修复产品，其具有较好的创面愈合速度，但12周愈合率为54％，需要进一步改进。因此，亟需研究一种新的材料修复糖尿病皮肤溃疡。此材料不仅应来源广泛、制备简单，且制备过程中不会对患者造成二次伤害，同时免疫原性低，能快速促进溃疡创面愈合，从而克服现有糖尿病皮肤溃疡治疗手段中存在的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于糖尿病溃疡的细胞外基质修饰的修复材料及其制备方法。该方法制备得到的细胞外基质修饰的修复材料免疫原性低，能减少炎性期的持续时间，促进糖尿病皮肤溃疡创面愈合，并能够使皮肤附属器再生。同时此细胞外基质修饰的修复材料和细胞来源广泛、不会对患者造成二次伤害。克服了现有糖尿病溃疡修复材料细胞来源有限、获取有创、难以存活，材料制备过程复杂、获取形成的二次创伤、免疫原性强，创面易发生感染的缺点。本专利技术为实现其专利技术目的提供了一种用于糖尿病溃疡的修复材料，它为人尿源性干细胞细胞外基质修饰的小肠黏膜下层膜。进一步地，所述的修复材料制备方法如下：取复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜，脱细胞处理，即可；所述小肠黏膜下层膜每3.14cm2上复合(8～10)×104个人尿源性干细胞。进一步地，所述脱细胞处理方法为反复冻融联合DNaseⅠ处理法，或TritonX-100联合DNaseⅠ处理法；优选的，所述反复冻融联合DNaseⅠ处理法的处理过程为：取复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜，洗涤，冷冻，解冻，DNaseⅠ溶液漂洗，洗涤，以上步骤重复1次或多次；进一步优选为以上步骤重复2次；优选的，所述TritonX-100联合DNaseⅠ处理法的处理过程为：取复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜，洗涤，TritonX-100溶液漂洗，DNaseⅠ溶液漂洗，洗涤，以上步骤重复1次或多次。进一步地，所述洗涤为使用PBS清洗3～6次；所述冷冻为在液氮中快速冷冻，冷冻时间为5～15min；所述解冻为在室温下缓慢解，解冻时间为20～30min；所述DNaseⅠ溶液的浓度为100U/mL，漂洗时间为5min；所述TritonX-100溶液的浓度为0.5％，漂洗时间为5min。进一步地，所述小肠黏膜下层膜制备方法如下：取小肠，去除浆膜层和肌层，脱脂，脱细胞，去垢，冻干，灭菌。进一步地，所述脱脂是用体积比为1:1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡6-24小时，去离子水冲洗；和/或，所述脱细胞采用酶消化，在24-40℃环境中，于胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合溶液中孵育6-24小时，生理盐水冲洗去除胰酶；优选地，所述混合溶液中，胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的浓度均为0.01～10％w/v，进一步优选为0.05％w/v；和/或，所述去垢是在含有过氧乙酸的乙醇水溶液中处理20～40分钟，所述含有过氧乙酸的乙醇水溶液中，过氧乙酸含量为0.01％-1％w/v，乙醇含量为10％-35％v/v,优选过氧乙酸含量为0.1％w/v，乙醇含量为20％v/v；和/或，所述灭菌是利用环氧乙烷灭菌。进一步地，所述人尿源性干细胞提取方法如下：取尿液，离心富集，培养。进一步地，所述离心富集的方法是：在离心管中进行400g离心10min，弃去上层尿液，加入尿液0.16～0.8倍体积的含1％青链霉素的PBS溶液，与底部尿液混匀并400g离心5min；重复PBS溶液洗涤的步骤两遍；所述培养采用的培养基为人尿源性干细胞培养基。本专利技术提供了一种制备前述修复材料的方法，其特征在于：它包括以下步骤：取复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜，脱细胞处理，即可；所述小肠黏膜下层膜每3.14cm2上复合(8～10)×104个人尿源性干细胞。进一步地，所述脱细胞处理方法为反复冻融联合DNaseⅠ处理法，或TritonX-100联合DNaseⅠ处理法；优选的，所述反复冻融联合DNaseⅠ处理法的处理过程为：取复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜，洗涤，冷冻，解冻，DNaseⅠ溶液漂洗，洗涤，以上步骤重复1次或多次；进一步优选为以上步骤重复2次；优选的，所述TritonX-100联合DNaseⅠ处理法的处理过程为：取复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜，洗涤，TritonX-100溶液漂洗，DNaseⅠ溶液漂洗，洗涤，以上步骤重复1次或多次；优选的，所述洗涤为使用PBS清洗3～6次；所述冷冻为在液氮中快速冷冻，冷冻时间为5～15min；所述解冻为在室温下缓慢解，解冻时间为20～30min；所述DNaseⅠ溶液的浓度为100U/mL，漂洗时间为5min；所述TritonX-100溶液的浓度为0.5％，漂洗时间为5min。进一步地，所述复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜的制备方法如下：将人尿源性干细胞的细胞悬液接种至小肠黏膜下层膜表面，即可；其中，细胞悬液的密度为(0.5～2)×106个细胞/mL，优选地，细胞悬液的密度为1×106个细胞/mL；小肠黏膜下层膜直径为2cm。本专利技术还提供了前述修复材料在制备治疗糖尿病溃疡的修复材料中的用途。本专利技术一种用于糖尿病溃疡的细胞外基质修饰的修复材料及其制备方法，具有下述有益效果：1)本专利技术使用的细胞和材料来源广泛，且细胞获取和材料制备过程中无创伤性，不会对患者造成二次伤害；2)本专利技术制备细胞外基质修饰的修复材料时，使用的脱细胞方法不仅能除去材料上的细胞，又能在材料上保留更多的细胞外基质和基质中的生长因子，除去材料免疫原性，减少炎性期的持续时间；3)本专利技术制备的糖尿病大鼠全层皮肤缺损防收缩模型，能够减少创面修复过程中大鼠上皮的收缩，更准确地观察和比较实验组和对照组上皮爬行情况；4)本专利技术制备的细胞外基质修饰的修复材料，既具有良好的生物相容性，又具有良好的生物活性，能够有效的促进糖尿病溃疡的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于糖尿病溃疡的修复材料，其特征在于：它是人尿源性干细胞细胞外基质修饰的小肠黏膜下层膜。

【技术特征摘要】
1.一种用于糖尿病溃疡的修复材料，其特征在于：它是人尿源性干细胞细胞外基质修饰的小肠黏膜下层膜。2.根据权利要求1所述的修复材料，其特征在于：所述的修复材料制备方法如下：取复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜，脱细胞处理，即可；所述小肠黏膜下层膜每3.14cm2上复合(8～10)×104个人尿源性干细胞。3.根据权利要求2所述的修复材料，其特征在于：所述脱细胞处理方法为反复冻融联合DNaseⅠ处理法，或TritonX-100联合DNaseⅠ处理法；优选的，所述反复冻融联合DNaseⅠ处理法的处理过程为：取复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜，洗涤，冷冻，解冻，DNaseⅠ溶液漂洗，洗涤，以上步骤重复1次或多次；进一步优选为以上步骤重复2次；优选的，所述TritonX-100联合DNaseⅠ处理法的处理过程为：取复合了人尿源性干细胞的小肠黏膜下层膜，洗涤，TritonX-100溶液漂洗，DNaseⅠ溶液漂洗，洗涤，以上步骤重复1次或多次。4.根据权利要求3所述的修复材料，其特征在于：所述洗涤为使用PBS清洗3～6次；所述冷冻为在液氮中快速冷冻，冷冻时间为5～15min；所述解冻为在室温下缓慢解，解冻时间为20～30min；所述DNaseⅠ溶液的浓度为100U/mL，漂洗时间为5min；所述TritonX-100溶液的浓度为0.5％，漂洗时间为5min。5.根据权利要求1～4任意一项所述的修复材料，其特征在于：所述小肠黏膜下层膜制备方法如下：取小肠，去除浆膜层和肌层，脱脂，脱细胞，去垢，冻干，灭菌。6.根据权利要求5所述的修复材材料，其特征在于：所述脱脂是用体积比为1:1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡6-24小时，去离子水冲洗；和/或，所述脱细胞采用酶消化，在24-40℃环境中，于胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合溶液中孵育6-24小时，生理盐水冲洗去除胰酶；优选地，所述混合溶液中，胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的浓度均为0.01～10％w/v，进一步优选为0.05％w/v；和/或，所述去垢是在含有过氧乙酸的...

【专利技术属性】
技术研发人员：解慧琪，汪祝乐，黄益洲，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川,51