一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法技术

本发明专利技术公开一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法，采用苹果酸和聚乙烯亚胺(PEI)为前驱体利用水热法一步制备出PEI功能化的绿色荧光碳点，方法简单易行、原料廉价易得、成本低、产出高，适合批量生产，制备的碳点发射波长长；本发明专利技术为高阳离子密度的PEI功能化碳点，不仅可以提高了碳点的发光效率和分散性，同时还能使碳点表面带有丰富的正电荷、量子产率高；基于绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，碳点和适配体均未修饰，采用了免标记的方法，很大程度的简化了合成步骤，同时降低了；具有操作成本低、制备工艺简单，反应条件温和易于推广的特点。

A PEI-functionalized green fluorescent carbon dot preparation method and thrombin detection method based on the carbon dot

The invention discloses a preparation method of PEI functionalized green fluorescent carbon dots and a thrombin detection method based on the carbon dots. The PEI functionalized green fluorescent carbon dots are prepared by hydrothermal method using malic acid and polyethylenimine (PEI) as precursors. The method is simple and feasible, the raw materials are cheap and easy to obtain, the cost is low, the output is high, and the prepared carbon dots are suitable for mass production, and the emission wavelength of the prepared carbon dots is long. The invention of PEI functionalized carbon dots with high cation density can not only improve the luminescence efficiency and dispersion of carbon dots, but also make the surface of carbon dots with abundant positive charges and high quantum yield. Based on the green fluorescent carbon dots thrombin detection method, carbon dots and adapters are not modified, and the label-free method is adopted, which greatly simplifies the synthesis process and reduces the production of thrombin. It has the characteristics of low operation cost, simple preparation process, mild reaction conditions and easy popularization.

【技术实现步骤摘要】
一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法
本专利技术属于荧光碳纳米材料、生物传感
，涉及一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法。
技术介绍
碳点是一种新型的零维碳纳米材料。除了具有优良的荧光性能，碳点还具有毒性低、生物相容性好、制备步骤简单温和、易于表面修饰以及原料丰富廉价等优点。因此，碳点可作为半导体量子点和有机染料的替代物而被应用于生物医学领域。目前碳点的合成方法主要有激光烧蚀法、电化学法、热解法、酸氧化法、微波法、超声法和水热法。采用不同的制备方法得到的碳点性能亦有所不同。然而，这些方法所制备的碳点绝大部分限于短波长发光，大多发出蓝色荧光，而生物体的细胞或组织具有较强的自体蓝色荧光，将这些碳点用于细胞成像或生物组份测定时不利于靶信号与背景信号的区分，背景干扰大。虽然近两年来已有关于长波长荧光碳点的报道，但是这些前瞻性的工作仍然存在着许多亟待解决的问题，主要表现在碳点的荧光在长波长区域(大于500nm)发射效率低以及水溶性差的缺陷，从而限制了碳点在生物医学等领域的进一步发展应用。因此，制备长波长高荧光量子产率的碳点是目前人们一直追求的目标。凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在血液凝固、血管生成、肿瘤生长和转移的诊断等分子生物学中发挥着重要作用。此外，凝血过度还会导致体内血栓栓塞等疾病的发生，甚至会造成机体死亡。因此，建立简单、快速检测凝血酶含量的方法对临床疾病的早期诊断、病程发展、预后以及疗效的监测和评估等都具有非常重要的意义。核酸适配体是一类寡核苷酸序列，通过其特定的三维结构可以与靶标高特异性、高亲和力地结合，且目标分子范围广，不仅能特异性识别小分子、蛋白质，甚至还可以与整个细胞结合。这表明核酸适配体作为识别元件可明显地拓宽相关传感器的应用范围。近年来，基于适配体的荧光生物传感器已成为代替传统检测方法的潜在选择。一系列用于凝血酶检测的荧光适配体传感器已有报道。但这些方法往往需要对适配体进行化学修饰或利用一些先进的纳米材料、荧光素等作为荧光基团来标记核酸适配体，这样的修饰和标记工作不仅耗时、复杂、增加了成本而且降低了核酸适配体对目标物的亲和力。因此，发展非标记型荧光适配体传感器用于凝血酶检测尤为重要。
技术实现思路
为克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种制备强烈绿色荧光的PEI功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法，制备的碳点长波长、量子产率高，并提供了一种以正电荷碳点作为荧光探针，适配体作为识别探针高选择性的凝血酶检测新方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法，包括以下步骤：(1)、按质量比1:5～4:1将苹果酸和PEI溶于超纯水中，搅拌均匀后置于反应釜中，在120～220℃条件下水热反应3～12h，得到棕黄色溶液；(2)、将步骤(1)得到的棕黄色溶液经过抽滤，除去大颗粒杂质，滤液经真空干燥，得到固体粉末；(3)、向步骤(2)得到的固体粉末中加入无水乙醇，超声后并离心，除去上清液、沉淀冷冻干燥得到纯化的碳点。进一步，所述步骤(3)中离心转速为13000rpm-16000rpm，离心时间为10-30min。进一步，所述步骤(2)中抽滤滤膜孔径为0.22μm。进一步，所述步骤(2)中真空干燥温度为50℃。一种基于绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，包括以下步骤：(1)、荧光淬灭：将凝血酶适配体加入到碳点分散液中，即制备成检测凝血酶的P-CDs-适配体传感器；适配体能淬灭正电荷碳点(P-CDs)荧光；(2)、凝血酶的检测：加入凝血酶，适配体结合凝血酶后，正电荷碳点(P-CDs)的荧光得以恢复，根据荧光恢复强度的变化，实现对凝血酶的检测。进一步，所述步骤(2)中，通过在EP管中依次加入正电荷碳点(P-CDs)、凝血酶适配体、NaCl、MgCl2、磷酸盐缓冲溶液，反应30min后，再加入凝血酶溶液，孵育一段时间，孵育后的溶液进行荧光强度测定。进一步，正电荷碳点(P-CDs)与凝血酶适配体在磷酸盐缓冲液混合，磷酸盐缓冲液中磷酸盐溶液浓度为10mM、NaCl浓度为100mM；Mg2+浓度为4mM、凝血酶浓度为1～200nM。进一步，所述孵育时间为40min。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术的PEI功能化绿色荧光碳点制备方法，采用苹果酸和聚乙烯亚胺(PEI)为前驱体利用水热法一步制备出PEI功能化的绿色荧光碳点。1、合成方法简单：本专利技术的绿色荧光碳点制备方法通过两个分子简单的一步水热合成即可得到绿色荧光碳点，方法简单易行、原料廉价易得、成本低、产出高，适合批量生产，制备的碳点发射波长长，最大发射波长位于502nm，见图3。而目前文献报道的大多数方法制备的碳点在紫外光激发下发射出蓝色荧光，主要发射峰在410-440nm。2.水溶性好、荧光量子产率高：采用苹果酸和聚乙烯亚胺(PEI)制备得到高阳离子密度的PEI功能化碳点，不仅可以提高了碳点的发光效率和分散性，同时还能使碳点表面带有丰富的正电荷、量子产率高。同时提供了一种基于绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，基于绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，正电荷碳点(P-CDs)溶液有良好的荧光发射性质，将凝血酶适配体加入到P-CDs溶液中时，带负电荷的适配体因与正电荷碳点之间的静电作用而吸附到P-CDs表面而使碳点荧光淬灭，在适配体/P-CDs复合物体系中加入凝血酶，凝血酶与适配结合从而使其远离P-CDs表面，导致P-CDs的荧光恢复，随着凝血酶浓度的增加，P-CDs的荧光恢复的程度逐渐增强，P-CDs的荧光强度与凝血酶浓度呈线性关系，可用于对凝血酶的灵敏和选择性检测。1.本方法无需标记，降低了检测成本：在本专利技术中碳点和适配体均未修饰，采用了免标记的方法，很大程度的简化了合成步骤，同时降低了；具有操作成本低、制备工艺简单，反应条件温和易于推广的特点。2.灵敏度、选择性高：本专利技术采用了“off-on的”荧光检测模式，利用了凝血酶与适配体之间强的特异性结合，这种体系可以显著提高检测的灵敏度和选择性。3.准确性高：检测时碳点和适配体均无需任何修饰，运用在定量检测凝血酶中很大程度的减小了外界干扰。4.实用性强：本专利技术检测方法是一种共性检测，只需改变核酸适配体的序列，就可以实现对其它底物分子的检测。附图说明图1为本专利技术实施例1制备的绿色P-CDs的透射电子显微镜照片图2为本专利技术实施例1制备的绿色P-CDs的粒径统计分布图图3为本专利技术实施例1制备的绿色P-CDs的紫外-可见吸收光谱图和荧光发射光谱图图4为本专利技术实施例1制备的绿色P-CDs在不同激发波长下(310-450nm)的荧光发射光谱图图5为本专利技术实施例1制备的绿色P-CDs的红外光谱图图6为适配体/P-CDs复合物与不同浓度凝血酶的荧光光谱图图7为对凝血酶检测的选择性图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细描述，但不作为对本专利技术的限定。实施例1PEI功能化绿色荧光碳点制备方法：(1)将0.5gPEI与0.5g苹果酸溶于13mL超纯水中，搅拌均匀后置于反应釜中，在180℃条件下水热反应10h得到棕黄色溶液；(2)将步骤(1)得到的棕黄色溶液经过孔径为0.22μm的滤膜抽滤，除去大颗粒杂质，滤液经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、按质量比1:5～4:1将苹果酸和PEI溶于超纯水中，搅拌均匀后置于反应釜中，在120～220℃条件下水热反应3～12h，得到棕黄色溶液；(2)、将步骤(1)得到的棕黄色溶液经过抽滤，除去大颗粒杂质，滤液经真空干燥，得到固体粉末；(3)、向步骤(2)得到的固体粉末中加入无水乙醇，超声后并离心，除去上清液、沉淀冷冻干燥得到纯化的碳点。

【技术特征摘要】
1.一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、按质量比1:5～4:1将苹果酸和PEI溶于超纯水中，搅拌均匀后置于反应釜中，在120～220℃条件下水热反应3～12h，得到棕黄色溶液；(2)、将步骤(1)得到的棕黄色溶液经过抽滤，除去大颗粒杂质，滤液经真空干燥，得到固体粉末；(3)、向步骤(2)得到的固体粉末中加入无水乙醇，超声后并离心，除去上清液、沉淀冷冻干燥得到纯化的碳点。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中离心转速为13000rpm-16000rpm，离心时间为10-30min。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中抽滤滤膜孔径为0.22μm。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中真空干燥温度为50℃。5.一种基于权利要求1制备的绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、荧光淬灭...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭颖，张君才，张卫红，
申请(专利权)人：咸阳师范学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61