一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用技术

一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供了一种过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA、聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase的基因工程菌，显著地提高了间苯三酚生产菌株合成间苯三酚的产量，通过摇瓶发酵，改造的菌株合成间苯三酚的产量是对照菌株的1.85倍。本发明专利技术可用于间苯三酚的工业化生产。

A Genetically Engineered Bacteria for Increasing Phloroglucinol Yield and Its Construction Method and Application

The invention relates to a genetically engineered bacterium for increasing the production of resorcinol and its construction method and application, belonging to the field of genetic engineering technology. The invention provides a genetic engineering bacterium that overexpresses tpiA, phlD, multiple resistance activator marA and ACCase gene of propionate isomerase gene, and acetyl CoA carboxylase gene. The production of phloroglucinol synthesized by phloroglucinol producing strain is significantly increased. By shaking flask fermentation, the production of phloroglucinol synthesized by the modified strain is 1.85 times that of the control strain. The invention can be used for industrial production of resorcinol.

【技术实现步骤摘要】
一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
间苯三酚又名1,3,5-三羟基苯，是一种重要的精细化工产品。间苯三酚本身就是一种药物，可以用作低毒平滑肌松弛剂；其衍生物三甲氧基苯是一种有效的镇静剂，已被用作化妆品添加剂。间苯三酚的硝基化合物三硝基间苯三酚是一种重要的炸药也是几种其他爆炸物的合成中间体。20世纪初就建立了间苯三酚的化学合成途径，并经过许多研究人员的逐渐改进，但化学合成法仍存在多种弊端，如副产物较多、分离提纯困难、环境污染严重等。间苯三酚化合物是一大类次级代谢产物，已经从不同的天然来源中分离出700多种天然存在的间苯三酚衍生物，包括植物，海洋生物和微生物。以微生物发酵生产间苯三酚，可以克服化学法的多种弊端，并且生物法合成间苯三酚周期短，安全环保。但目前微生物发酵法合成间苯三酚产量较低，无法用于工业化生产。仍需通过对产间苯三酚工程菌进行基因改造，以提高间苯三酚产量。
技术实现思路
为解决生物法合成间苯三酚产量过低的问题，本专利技术提供了一种高间苯三酚合成能力的基因工程菌，所述基因工程菌过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA、聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase，出发菌株为大肠杆菌。进一步地限定，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA来源于大肠杆菌K-12，GenebankID：948409；或者为来源于其他生物体，与基因tpiA同源性超过70％的基因。进一步地限定，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA与大肠杆菌K-12中基因tpiA同源性低于70％，但其编码的蛋白与蛋白TpiA功能相同或相似。更进一步地限定，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述聚酮合成酶基因phlD的核苷酸序列如SEQIDNo：2所示；所述多重抗性激活因子marA的核苷酸序列如SEQIDNo：3所示；所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase亚基accA的GenebankID：6062185，亚基accB的GenebankID：6058890，亚基accC的GenebankID：6058863，亚基accD的GenebankID：6059083。本专利技术还提供了所述提高间苯三酚产量的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：1)制备含有磷酸丙糖异构酶基因tpiA的重组质粒；2)将步骤1)所得重组质粒与产间苯三酚的重组质粒一起导入到宿主菌中，获得重组菌株；所述产间苯三酚的重组质粒含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase；该质粒记载在ZhangR,CaoY,LiuW,etal.ImprovingphloroglucinoltoleranceandproductioninEscherichiacolibyGroESLoverexpression.MicrobialCellFactories,2017,16(1):227；所述宿主菌为大肠杆菌。进一步地限定，步骤1)是将磷酸丙糖异构酶基因tpiA连接到载体pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-tpiA。更进一步地限定，步骤1)所述的重组质粒的制备，是以大肠杆菌K-12基因组DNA为模版，经PCR扩增获得磷酸丙糖异构酶基因tpiA，将磷酸丙糖异构酶基因tpiA与pETDuet-1载体分别经NdeI和BglII限制性内切酶双酶切后，将酶切后的磷酸丙糖异构酶基因tpiA与pETDuet-1载体大片段5413bp连接，制备获得重组质粒；所述PCR扩增的正向引物tpiA-F，序列如SEQIDNO：4所示；反向引物tpiA-R，序列如SEQIDNO:5所示。本专利技术还提供了上述基因工程菌的应用：将构建获得的基因工程菌，用于发酵生产间苯三酚。进一步地限定，所述的应用是指将本专利技术所构建的基因工程菌接种至发酵培养基中生产间苯三酚。所述发酵培养基成分为：K2HPO4·3H2O9.8g/L，C6H8O7·H2O2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH4)2SO43.0g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，1000×微量元素((NH4)6Mo7O24·4H2O3.7g/L，ZnSO4·7H2O2.9g/L，H3BO324.7g/L，CuSO4·5H2O2.5g/L，MnCl2·4H2O15.8g/L)，所述各成分浓度均为在发酵培养基中的终浓度；接种时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL，氯霉素终浓度34μg/mL。更进一步地限定，当所述基因工程菌培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导后获得间苯三酚。定义和缩写在本文中使用下列的缩写或简称：间苯三酚(Phloroglucinol)：PG异丙基硫代半乳糖苷：IPTG磷酸丙糖异构酶基因：tpiA聚酮合成酶基因：phlD多重抗性激活因子：marA乙酰CoA羧化酶基因：ACCase大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)：E.coli“过量表达”或“过表达”指细胞内特定基因受到各种信号调控后，在生物体中超过原有水平表达，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。有益效果本专利技术在大肠杆菌中过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA，所得基因工程菌间苯三酚合成能力有较大提高，采用摇瓶发酵结束时间苯三酚产量可达到1.5g/L，是未过表达基因tpiA菌株的1.85倍，该方法为间苯三酚生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。附图说明图1摇瓶发酵间苯三酚产量曲线图，横坐标为IPTG诱导后的培养时间(h)，纵坐标为间苯三酚产量(g/L)。具体实施方式下面通过实例来详细阐明本专利技术。但本专利技术并不限于以下实施例。下述实施例中所涉及的实验方法若无特殊说明，均为常规技术。下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。所用限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自ThermoScientific公司，pETDuet-1载体购买自Novagen，质粒提取及胶回收所用试剂盒购自美国Omega公司，操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。培养基配方：1)种子液培养基LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，接种时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL，加入氯霉素至终浓度34μg/mL。2)发酵培养基K2HPO4·3H2O9.8g/L，C6H8O7·H2O2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH4)2SO43.0g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，1000×微量元素((NH4)6Mo7O24·4H2O3.7g/L，ZnSO4·7H2O2.9g/L，H3BO324.7g/L，CuSO4·5H2O2.5g/L，MnCl2·4H2O15.8g/L)，接种时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL，氯霉素终浓度34μg/mL。其中：K2HPO4·3H2O9.8g/L，C6H8O7·H2O2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH4)2SO43.0g/L混合后调至pH7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为625g/L，115℃，30min单独灭菌；Mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高间苯三酚产量的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA、聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase，出发菌株为大肠杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种提高间苯三酚产量的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达磷酸丙糖异构酶基因tpiA、聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase，出发菌株为大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的提高间苯三酚产量的基因工程菌，其特征在于，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA来源于大肠杆菌K-12，GenebankID：948409；或者为来源于其他生物体，与基因tpiA同源性超过70％的基因。3.根据权利要求1所述的提高间苯三酚产量的基因工程菌，其特征在于，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA与大肠杆菌K-12中基因tpiA同源性低于70％，但其编码的蛋白与蛋白TpiA功能相同或相似。4.根据权利要求1所述的提高间苯三酚产量的基因工程菌，其特征在于，所述磷酸丙糖异构酶基因tpiA，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述聚酮合成酶基因phlD的核苷酸序列如SEQIDNo：2所示；所述多重抗性激活因子marA的核苷酸序列如SEQIDNo：3所示；所述乙酰CoA羧化酶基因ACCase亚基accA的GenebankID：6062185，亚基accB的GenebankID：6058890，亚基accC的GenebankID：6058863，亚基accD的GenebankID：6059083。5.权利要求1-4任意一项所述提高间苯三酚产量的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备含有磷酸丙糖异构酶基因tpiA的重组质粒；2)将步骤1)所得重组质粒与产间苯三酚的重组质粒一起导入到宿主菌中，获得重组菌株；所述产间苯三酚的重组质粒含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰CoA羧化酶基因ACCase；所述宿主菌为大肠杆菌。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张汝兵，咸漠，刘闻，孙超，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37