一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法技术

本发明专利技术公开了大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，包括如下步骤：（1）培养基的配制；（2）接种；（3）菌体培养。本发明专利技术提供了一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，在保持较高的单位菌体质粒含量的基础上，能显著提高大肠杆菌的纯度，不需要进行菌体的纯化培养，简化了大肠杆菌的培养过程，提高了质粒DNA的纯度和含量，具有很好的市场推广应用价值。

A Culture Method for High-efficient Expression of Plasmid DNA in Escherichia coli

The invention discloses a method for cultivating high-efficient expression plasmid DNA of Escherichia coli, which comprises the following steps: (1) preparation of culture medium; (2) inoculation; (3) culture of bacteria. The present invention provides a method for cultivating E. coli plasmid DNA with high expression efficiency. On the basis of maintaining high plasmid content per unit bacterium, the purity of E. coli can be significantly improved, and the purification and cultivation of E. coli are not required, the cultivation process of E. coli is simplified, the purity and content of plasmid DNA are improved, and the method has good market popularization and application value.

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法。
技术介绍
质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞（如大肠杆菌）中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。细菌的培养作为生产质粒DNA的第一步，在整个生产过程中起着关键的作用。它兴驻直接影响到质粒DNA的产量，而且也影响下续步骤的进行。因此，选择和优化菌体的生长条件，是产生大量稳定的质粒DNA必要条件，特别是培养基的组成成分和浓度对细菌的生长和质粒DNA的含量有较大的影响。现有的运用于质粒DNA工程菌高密度表达的培养基虽然可以达到较高的菌体密度和质粒总量的目标，但质粒DNA比含量普遍较低，利用现有的培养基配方，虽然质粒DNA含量有了一定程度的提高，但结果仍不令人满意。而且现有的大肠杆菌的培养方法，首先需要对菌液进行纯化处理，再进行扩大培养，质粒提取完成后，需要花费大量的人力和物力去进行纯化，造成资源的极大浪费，而且所提取的质粒DNA的质量却不尽人意。因此，急需要开发一种适用于大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的问题，提供了一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，在保持较高的单位菌体质粒含量的基础上，能显著提高大肠杆菌的纯度，不需要进行菌体的纯化培养，简化了大肠杆菌的培养过程，提高了质粒DNA的纯度和含量，具有很好的市场推广应用价值。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，包括如下步骤：（1）培养基的配制：a.称取相应重量份的牛肉膏2.5~3.5份、蛋白胨10.5~11.5份、氯化钠2.2~2.8份、改性碳酸镧3.2~3.8份、活性炭1.2~1.8份、酒石酸0.32~0.38份、柠檬酸0.12~0.18份、甘油12.5~13.5份、去离子水820~880份备用；b.将操作a中称取的牛肉膏、蛋白胨、氯化、改性碳酸镧、活性炭、酒石酸、柠檬酸、甘油、去离子水共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度控制为97~99℃，持续搅拌32~38min，在搅拌的同时进行射线辐照处理；c.等到操作b中所得溶液内的温度降至42~48℃时，用1.2~1.8mol/L的盐酸溶液或1.2~1.8mol/L的氢氧化钠溶液将操作b中所得的溶液的pH调至7.4~7.6；（2）接种：取100~120μL氨苄青霉素投入200~300mL步骤（1）所配制的培养基中，然后取100~120μL大肠杆菌DH5α菌株接种到添加有氨苄青霉素的培养基中，再称取特制的复合粉投入含有菌株和氨苄青霉素的培养基中；（3）菌体培养：将步骤（2）中的培养基置于恒温摇床上进行菌株培养，在培养的同时进行声光波交替联合处理，摇菌培养直到菌液的OD600达到0.9~1即可。进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改性碳酸镧的制备方法包括如下步骤：1）将碳酸镧投入质量分数为2.5~3.5%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时保持盐酸溶液中的温度为62~68℃，浸泡处理10.5~11.5min后滤出备用；2）将步骤1）中酸液浸泡处理后的碳酸镧投入质量分数为4.2~4.8%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时保持氢氧化钠溶液中的温度为92~98℃，浸泡处理17~19min后滤出备用；3）将步骤2）中氢氧化钠浸泡处理后的碳酸镧和改性液按照质量体积比为1g:32~38mL共同投入反应釜中，将反应釜中的压力控制为0.42~0.48MPa，反应釜内的温度控制为220~280℃，处理21~23min后过滤得滤渣；4）将步骤3）中所得的滤渣投入烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为72~78℃，干燥至含水率为3~4%即可。进一步的，所述步骤3）中改性液中各成分及对应重量份为：甘油21~25份、辛基酚聚氧乙烯醚3.5~4.5份、十四烷基三甲基溴化铵12.5~13.5份、十六烷基磺酸钠13.5~14.5份、去离子水420~480份。进一步的，所述步骤（1）操作b中射线辐照的形式为β射线，辐照的剂量为2.2~2.8Gy/min。进一步的，所述步骤（2）中氨苄青霉素的浓度为16~20μL/mL。进一步的，所述步骤（2）中特制的复合粉的制备方法是：将苹果酸和碳酸氢钠按照重量比为1:2~2.4混匀后，置于紫外灯下进行灭菌处理，灭菌处理的时间为30~40min。进一步的，所述步骤（3）中菌株培养时保持恒温培养箱内的温度为35~37℃，摇床的转速为200~220rpm。进一步的，所述步骤（3）中声光波交替联合处理的程序为：首先用频率为20~24kHz的超声波处理14~18min，然后用波长为430~440nm的光波处理8~12min，再用频率为20~24kHz的超声波和波长为430~440nm的光波联合处理5~7min。本专利技术提供了一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，从培养基和培养方法两方面进行改进，首先是所使用的培养基，本专利技术在现有的大肠杆菌培养基配方的基础上做了很大的改进，在配方中添加了改性碳酸镧，将碳酸镧先后经过酸液和碱液浸泡处理，软化碳酸镧表面，为后续的改性处理奠定基础，然后在高温高压的条件下进行改性处理，改性液中的甘油可以增加改性液的流动性，提高碳酸镧表面的活性，阳离子型十四烷基三甲基溴化铵和阴离子型十六烷基磺酸钠复配制成，用其作为改善修饰剂对碳酸镧表面进行改性处理，改善了碳酸镧表面的反应活性，以及与培养基中其他成分之间的相容性，改性后的碳酸镧添加到培养基中，有助于增强培养基中其他原料成分的凝结性，促进工程菌对有效成分的吸收，提高菌液的繁殖速度，改性碳酸镧表面具有巨大的分子网状结构，可以吸收工程菌的代谢废物，有效的防止细菌代谢物对其他活菌的毒害作用，使活菌可以高效表达。因为菌体的长期保存的过程中，难免会产生部分死菌和毒性代谢物，本专利技术添加的活性炭与改性碳酸镧配合使用，进一步改善培养基的品质，保证菌体的健康快速繁殖。申请人在大量的实验中发现在菌体培养基中添加酒石酸、柠檬酸等可以抑制革兰氏阳性菌的生长，增加培养基的选择性，保证了大肠杆菌的纯度，但是添加单一的某种酸对于提高大肠杆菌的纯度只有很小的改善作用，申请人在大量的实验中将酒石酸和柠檬酸合理搭配，配合使用对于提高大肠杆菌的纯度具有很好的改善作用，进而提高质粒DNA的纯度，减少了质粒纯化的操作成本。在培养基的制备过程中，进行β射线辐照处理，β射线激发产生活化原子和活化分子，增加培养基的抗微生物能力，防止培养基遭受杂菌的侵染，射线辐照可以辅助培养基的制备，加快培养基中有效成分之间的交联、聚合，提高培养基营养的均衡性。在接种时在培养基中添加复合粉，复合粉为经过灭菌的苹果酸和碳酸氢钠的混合粉末，添加的复合粉添加到培养基中，会在菌体培养的过程中，释放二氧化碳，大肠杆菌是兼性厌氧菌，二氧化碳提供厌氧的环境，提高菌体的选择性，有利于提高质粒的纯度。在菌体培养的过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）培养基的配制：a. 称取相应重量份的牛肉膏2.5~3.5份、蛋白胨10.5~11.5份、氯化钠2.2~2.8份、改性碳酸镧3.2~3.8份、活性炭1.2~1.8份、酒石酸0.32~0.38份、柠檬酸0.12~0.18份、甘油12.5~13.5份、去离子水820~880份备用；b. 将操作a中称取的牛肉膏、蛋白胨、氯化、改性碳酸镧、活性炭、酒石酸、柠檬酸、甘油、去离子水共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度控制为97~99℃，持续搅拌32~38min，在搅拌的同时进行射线辐照处理；c. 等到操作b中所得溶液内的温度降至42~48℃时，用1.2~1.8mol/L的盐酸溶液或1.2~1.8mol/L的氢氧化钠溶液将操作b中所得的溶液的pH调至7.4~7.6；（2）接种：取100~120μL氨苄青霉素投入200~300mL步骤（1）所配制的培养基中，然后取100~120μL大肠杆菌DH5α菌株接种到添加有氨苄青霉素的培养基中，再称取特制的复合粉投入含有菌株和氨苄青霉素的培养基中；（3）菌体培养：将步骤（2）中的培养基置于恒温摇床上进行菌株培养，在培养的同时进行声光波交替联合处理，摇菌培养直到菌液的OD600达到0.9~1即可。...

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）培养基的配制：a.称取相应重量份的牛肉膏2.5~3.5份、蛋白胨10.5~11.5份、氯化钠2.2~2.8份、改性碳酸镧3.2~3.8份、活性炭1.2~1.8份、酒石酸0.32~0.38份、柠檬酸0.12~0.18份、甘油12.5~13.5份、去离子水820~880份备用；b.将操作a中称取的牛肉膏、蛋白胨、氯化、改性碳酸镧、活性炭、酒石酸、柠檬酸、甘油、去离子水共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度控制为97~99℃，持续搅拌32~38min，在搅拌的同时进行射线辐照处理；c.等到操作b中所得溶液内的温度降至42~48℃时，用1.2~1.8mol/L的盐酸溶液或1.2~1.8mol/L的氢氧化钠溶液将操作b中所得的溶液的pH调至7.4~7.6；（2）接种：取100~120μL氨苄青霉素投入200~300mL步骤（1）所配制的培养基中，然后取100~120μL大肠杆菌DH5α菌株接种到添加有氨苄青霉素的培养基中，再称取特制的复合粉投入含有菌株和氨苄青霉素的培养基中；（3）菌体培养：将步骤（2）中的培养基置于恒温摇床上进行菌株培养，在培养的同时进行声光波交替联合处理，摇菌培养直到菌液的OD600达到0.9~1即可。2.根据权利要求1所述一种大肠杆菌高效表达质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）操作a或操作b中改性碳酸镧的制备方法包括如下步骤：1）将碳酸镧投入质量分数为2.5~3.5%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时保持盐酸溶液中的温度为62~68℃，浸泡处理10.5~11.5min后滤出备用；2）将步骤1）中酸液浸泡处理后的碳酸镧投入质量分数为4.2~4.8%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时保持氢氧化钠溶液中的温度为92~98℃，浸泡处理17~19min后滤出备用；3）将步骤2）中氢氧化钠浸泡...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵建阳，王世凯，韦小艳，
申请(专利权)人：安徽欣伯玉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34