一株有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母制造技术

本发明专利技术涉及利用微生物进行环境或食品中污染物减除的领域，具体涉及一株从自然发酵红葡萄酒中分离出的对氯氰菊酯具有较高吸附能力的酿酒酵母。可有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株号为HP，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏；保藏号为CGMCC No.16134，保藏日期为2018年07月19日。该菌株除能吸附氯氰菊酯外，还对其它拟除虫菊酯类农药及其主要降解产物—3‑苯氧基苯甲基有一定吸附作用。本发明专利技术酿酒酵母HP可开发相应的生物制剂，用于环境和食品中拟除虫菊酯的脱除；或将该菌株开发成保健食品或药品，减少拟除虫菊酯类农药对人体暴露的危害。

A Saccharomyces cerevisiae strain adsorbing cypermethrin effectively

The invention relates to the field of using microorganisms to reduce pollutants in environment or food, in particular to a Saccharomyces cerevisiae with high adsorption capacity for cypermethrin separated from natural fermented red wine. The strain of Saccharomyces cerevisiae, which can effectively adsorb cypermethrin, is HP. It is registered and stored in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Committee. The storage number is CGMCC No. 16134 and the storage date is July 19, 2018. The strain can adsorb cypermethrin and other pyrethroid pesticides and their main degradation product - 3 -phenoxyphenyl methyl. The Saccharomyces cerevisiae HP of the invention can develop corresponding biological agents for the removal of pyrethroids from environment and food, or develop the strain into health food or medicine to reduce the harm of pyrethroid pesticides to human body.

【技术实现步骤摘要】
一株有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母
本专利技术涉及利用微生物进行环境或食品中污染物减除的领域，具体涉及一株从自然发酵红葡萄酒中分离筛选出的对氯氰菊酯具有较高吸附能力的酿酒酵母。
技术介绍
氯氰菊酯(Cypermethrin，CY)是常用的拟除虫菊酯农药之一，主要用于果蔬、棉花、茶叶、谷物等作物及多种卫生害虫的防治。氯氰菊酯对光、热稳定，半衰期长，自然降解速率缓慢，在空气、水体、土壤、果蔬、茶叶、食用菌、水产品中有较高的检出率和超标率。研究显示，拟除虫菊酯类农药对高等哺乳动物可能具有生殖毒性、神经毒性、细胞毒性和免疫毒性，因此有效地减少和脱除环境与食品中残留的拟除虫菊酯已成为目前的研究热点。去除拟除虫菊酯类农药的常用方法有物理吸附法、化学降解法、生物降解法三种。上述方法均有局限性，如辐照法成本高，大孔吸附树脂使用过程繁琐，化学降解法、生物降解法可能会产生毒性更强的中间产物，很大程度上限制了其应用范围。微生物吸附剂作为一种有效去除有毒有害物质的技术手段，因其种类繁多、来源广泛、绿色、高效、经济等优点，受到了学者的广泛关注。目前用于吸附的微生物主要有细菌、霉菌、酵母菌等。与其他微生物相比，酵母菌对外部环境耐受性强、吸附效果好。研究表明，酵母菌可用于吸附重金属、真菌毒素、染料、植物生长调节剂等有毒有害物质，但未见有酵母菌用于拟除虫菊酯类农药吸附的相关报道。酿酒酵母广泛应用于啤酒、白酒、葡萄酒酿造及面包制作，也是我国农业部允许使用的饲料添加剂，安全性高。因此，有必要筛选获得吸附拟除虫菊酯类农药酿酒母并用于农药的减除。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术目的在于提供一株可有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HP及其应用。本专利技术所提供的菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株号HP，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCCNo.16134，保藏日期为2018年07月19日。本专利技术提供吸附菌株的分离、筛选、鉴定。取自然发酵红葡萄酒1mL加入9mL无菌生理盐水，混匀后进行10倍梯度稀释，取适宜稀释度样液100μL涂布于PDA平板上，28℃培养48~72h。挑取具有酵母菌典型菌落特征的单菌落进一步分离纯化，于PDA斜面培养基上培养后保存备用。将上述获得的酵母菌进行高效吸附氯氰菊酯菌株的体外筛选，取斜面菌种一环接入5mL的马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)中，28℃培养40~48h，然后按2%接种量连续活化两次。将菌液于8000r/min、4℃离心10min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水洗涤离心2次并重悬，调整细胞浓度为1.0×109CFU/mL。取1mL上述菌悬液于8000r/min、4℃离心10min，弃去上清液，加入1mL浓度为10mg/L的氯氰菊酯溶液，混匀。将混合液于30℃振荡培养12h，12000r/min离心15min，取上清液用高效液相色谱法(HPLC)测定氯氰菊酯浓度，以不含酵母菌细胞的10mg/L氯氰菊酯溶液作为空白对照，计算吸附率。所述HPLC检测方法为：Agilent1260-LC液相色谱仪，反相岛津InertSustainC18色谱柱规格为内径×长度=4.6mm×250mm、粒径=5μm，乙腈:超纯水=85:15为流动相，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL，检测器为二极管阵列检测器，检测波长210nm。氯氰菊酯吸附率的计算公式为：式中：C0为空白对照中氯氰菊酯的浓度(mg/L)；C为吸附体系中吸附后氯氰菊酯残留的浓度(mg/L)。菌株形态鉴定：平板菌落呈圆形、白色、中央凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、有发酵香气。酵母细胞呈椭圆形，出芽繁殖，无假菌丝。菌株生理生化鉴定：菌株发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，不发酵乳糖、纤维二糖；可以同化葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉，不能同化木糖、纤维二糖、山梨醇、甘露醇、柠檬酸；可以同化硫酸铵和尿素，不能同化硝酸钾。菌株HP分子遗传学鉴定。菌株HP经26SrDNA序列测定，获得如下序列：CGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG该菌株的26SrDNA基因测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast同源性对比，该菌株序列与Saccharomycescerevisiae菌株基因序列高度同源，得到登录号为MH143598，结合形态学和生理生化指标，最终将菌株HP鉴定为酿酒酵母。本专利技术所提供的高效吸附氯氰菊酯的菌株是从自然发酵红葡萄酒中分离筛选得到的，该菌株在一定温度和pH范围内均对氯氰菊酯有很好的吸附能力，吸附速度快，且灭活菌体同样具有氯氰菊酯吸附能力，在果蔬汁中脱除氯氰菊酯并不对果蔬汁色泽造成影响。本专利技术所用培养基为：马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)：新鲜土豆去皮切块，称取200g，加入500mL蒸馏水煮沸20min，过滤，加葡萄糖20g，再加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌20min。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：在PDB中加入2%琼脂即为PDA。与现有技术相比，本专利技术的积极效果是：首次从自然发酵红葡萄酒中筛选获得高效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母，酿酒酵母是食品工业常用的发酵菌种，也是农业部批准使用的饲料添加剂，该菌株来源安全，具有吸附快速、吸附能力强、操作简单等优点，可为环境和食品中残留氯氰菊酯的脱除提供良好菌源。附图说明图1为吸附菌株HP的菌落形态和细胞形态图。图2为培养时间对菌株吸附氯氰菊酯的影响。图3为培养温度对菌株吸附氯氰菊酯的影响。图4为pH对菌株吸附氯氰菊酯的影响。图5为菌体浓度对菌株吸附氯氰菊酯的影响。具体实施方式实例1：菌株HP对氯氰菊酯的吸附特性。1)培养时间对氯氰菊酯吸附率的影响将细胞浓度为1×109CFU/mL的菌株HP与10mg/L氯氰菊酯工作液在30℃下分别振荡培养15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h，测定不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HP，其特征在于保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No. 16134，保藏日期为2018年07月19日。

【技术特征摘要】
1.一株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HP，其特征在于保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCCNo.16134，保藏日期为2018年07月19日。2.根据权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HP，其特征在于：从红葡萄酒中分离筛选得到；细胞呈椭圆形，出芽繁殖，无假菌丝；菌落形态呈圆形、白色、中央凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、有发酵香气。3.根据权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)HP的应用，其特征在于：吸附速度快，在较宽温度、pH范围内均具有良好的吸附能力。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘书亮，张梦梅，文运玲，罗晓莉，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51