一种鉴定蛋白的方法及系统技术方案

本发明专利技术涉及一种鉴定蛋白的方法及系统，尤其涉及一种高效鉴定多克隆抗体的蛋白质组学方法和系统，所述方法包括如下步骤：(1)样本处理：将待测蛋白样本采用多酶串联酶解处理；(2)液质联用检测：将酶解处理后的肽段进行液相色谱分离和质谱检测；(3)数据分析：质谱原始下机数据过滤，依据构建的数据库对质谱数据进行搜库鉴定，获得鉴定肽段信息，依据鉴定肽段信息归并获得可信的待测蛋白。本发明专利技术为多克隆抗体的蛋白质组学分析提供标准的生物信息分析流程，可有效、简便、可靠的从多克隆抗体中获得特异性高、免疫反应性好的特异性抗体。

A Method and System for Identifying Proteins

The invention relates to a method and system for identifying proteins, in particular to a proteomics method and system for efficiently identifying polyclonal antibodies. The method comprises the following steps: (1) sample processing: sample processing: multi-enzyme tandem enzymatic hydrolysis of protein samples to be tested; (2) liquid chromatography-mass spectrometry detection: liquid chromatography separation and mass spectrometry detection of enzymatic hydrolyzed peptide segments; (3) data analysis The original data of mass spectrometry were filtered, and the mass spectrometry data were searched and identified according to the constructed database. The information of identified peptide segments was obtained, and the credible protein to be tested was obtained by merging the information of identified peptide segments. The present invention provides a standard bioinformatics analysis process for proteomics analysis of polyclonal antibodies, and can effectively, simply and reliably obtain specific antibodies with high specificity and good immunoreactivity from polyclonal antibodies.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定蛋白的方法及系统
本专利技术属于生物
，涉及一种鉴定蛋白的方法及系统，尤其涉及一种高效鉴定多克隆抗体的蛋白质组学方法和系统。
技术介绍
抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白，即抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。机体内形成的多种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。单克隆抗体的鉴定、筛选和制备从小鼠杂交瘤细胞法，噬菌体展示技术，一直发展到了蛋白组学法，但都不能直接用于多克隆抗体。多克隆抗体的制备主要是通过免疫动物的方式，抽取其外周血以后分离获得，但并没有用于鉴定多克隆抗体的方法。目前，对蛋白的质谱鉴定流程如下：蛋白质—酶解—液质联用—数据库搜索—鉴定结果，该方法都是对总蛋白的鉴定，然而对于抗体尤其是多克隆抗体的质谱鉴定是十分困难的。由于多克隆抗体中氨基酸序列由一般的框架保守区(FR区)和高变区(CDR区)交替，以及高保守区(CH区)组成，其相似度高；且多克隆抗体的免疫组库本身库容巨大，一般免疫组库序列多样性可达1011种以上，其多样性大；由于这些因素导致其无法直接鉴定，使得不论是从实验上还是从生物信息分析上对多抗的鉴定都显得十分困难。多克隆抗体鉴定不管是从科研上或经济前景上来看都具有非常重要的意义。目前蛋白质鉴定的原理是基于鸟枪法，将蛋白条带或者蛋白溶液酶切成肽段混合物，经高效液相色谱分离得到若干较为简单的组分，进入高分辨率质谱仪中进行分析。检索软件根据二级质谱信息与相应的数据库比对，结合匹配度打分及错配过滤，可得到肽段的确切序列，进而拼接出各蛋白的完整序列，从而实现对蛋白的鉴定。但该蛋白质鉴定的方法无法直接用于多克隆抗体的鉴定。现有技术尚无针对多克隆抗体的蛋白质谱鉴定技术，而对于单克隆抗体的鉴定，加拿大马斌团队的RapidNovor公司可以做到对单个抗体序列的100％覆盖denovo测序鉴定，具体过程如下：采用多种酶将抗体分解为重叠多肽，采用LC-MS/MS分析酶解后的片段，通过从头测序法分析重叠多肽，从分析得到的多肽中自动组装抗体序列。但该方法直接用于多克隆抗体的鉴定测序并不可行。因此，能开发出一套高效的专门鉴定多克隆抗体的蛋白组学研究系统，就显得尤为重要。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际需求，本专利技术提供一种鉴定蛋白的方法及系统，所述方法能够弥补现有技术中无法对多克隆抗体进行鉴定的缺陷，且能够建立和多抗相互对应的基于二代测序技术的免疫组库参考数据库。为达到此专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种鉴定蛋白的方法，包括如下步骤：(1)样本处理：将待测蛋白样本采用多酶串联酶解处理；(2)液质联用检测：将酶解处理后的肽段进行液相色谱分离和质谱检测；(3)数据分析：质谱原始下机数据进行过滤，依据构建的数据库对质谱数据进行搜库鉴定，获得鉴定肽段信息，依据鉴定肽段信息归并获得可信的待测蛋白。本专利技术中，采用多酶串联酶解的方式，大大提高了待测样本的酶解效率，再通过液相色谱分离和质谱检测，可以鉴定不同组分中的多肽及蛋白质分子量，从而有效提升了肽段和蛋白的鉴定效率。根据本专利技术，步骤(1)所述待测蛋白为多克隆抗体，优选为经过抗原亲和纯化的多克隆抗体。根据本专利技术，步骤(1)所述多酶串联酶解处理具体包括：(a)初步酶解；(b)SDS胶分离目标蛋白和/或肽段；(c)串联酶解步骤(b)中的目标蛋白和/或肽段。根据本专利技术，步骤(a)所述初步酶解为先采用酶处理分离得到所述可变区F(ab’)2片段，去除恒定区给鉴定过程中带来的噪音干扰，所述酶采用包括但不限于胃蛋白酶和/或木瓜蛋白酶，所述初步酶解的条件本领域技术人员可以根据所采用的酶的种类进行调整，在此不作特殊限定。本专利技术中，步骤(b)所述SDS胶分离目标蛋白和/或肽段，所述分离条件中的浓缩胶浓度和分离胶浓度为SDS-PAGE分离的常规浓度，在此不作特殊限定，本领域技术人员可以根据需要进行调整，本申请采用浓缩胶浓度5％，分离胶浓度12％，所述分离中每孔的上样量为5-6μg。根据本专利技术，步骤(b)所述的目标蛋白和/或肽段为抗体的可变区F(ab’)2。根据本专利技术，步骤(c)所述串联酶解具体包括：采用不同酶组合对抗体的可变区F(ab’)2片段进行串联酶解，所述不同酶组合为两种或两种以上酶依次酶切。本专利技术中，所述串联酶解的酶切顺序为酶切位点越少的酶放在越前面进行酶解，即对于同一个多克隆抗体，金黄色葡萄菌V8蛋白酶相比于胰蛋白酶，其酶切位点较少，酶切的顺序为金黄色葡萄菌V8蛋白酶先酶切，再用胰蛋白酶酶切，所述串联酶解的酶切顺序的确定是为了尽可能对目的多克隆抗体进行完全酶解，提高肽段的鉴定效率。根据本专利技术，对于不同的多克隆抗体，所述串联酶解的酶切顺序也不尽相同，本领域技术人员可以根据所要鉴定的多克隆抗体来调整酶切顺序，在此不做特殊限定，本专利技术对于兔子的GPC1(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1)多克隆抗体，所述串联酶解的具体酶切顺序为金黄色葡萄菌V8蛋白酶、胰蛋白酶进行酶切反应，还可以采用糜蛋白酶、胰蛋白酶进行酶切反应。根据本专利技术，步骤(2)液质联用检测包括对串联酶解后的组分进行色谱分离和质谱检测。根据本专利技术，所述液相-质谱仪为本领域常规的液相-质谱仪，本领域技术人员可以根据需要进行选择，在此不作特殊限定，本专利技术采用DIONEXUltiMate3000纳流液相色谱仪，ThermoScientificQExactiveHF质谱分析仪。根据本专利技术，所述色谱分离和质谱检测的条件只要能够进行酶解后待测蛋白的分离和检测都是可行的，本领域技术人员可以根据分离待测蛋白的不同进行调整，在此不作特殊限定。根据本专利技术，步骤(3)所述的数据库的构建具体包括：1)利用与所述多克隆抗体相同来源的抗体免疫组库的二代高通量测序结果进行参考数据库的构建，通过核酸序列翻译得到氨基酸序列；2)根据该氨基酸序列构建诱导库；3)将氨基酸序列和诱导库合并作为下游数据分析的数据库。本专利技术中，采用与多克隆抗体相同来源的抗体建立免疫组库，比如20mL外周血血样分离得到的血清和淋巴细胞，分别去纯化获得多克隆抗体和提取核酸建立免疫组库，二者在蛋白水平和基因水平有直接的对应关系；由此，所述多克隆抗体的质谱鉴定数据和抗体免疫组库二代高通量测序数据也有直接的对应关系，这比传统上拿NCBI等公共数据库上的蛋白数据作为参考序列更具有针对性。根据本专利技术，步骤(3)所述的过滤具体包括：采用Percolator软件对鉴定肽段进行谱图水平的1％的FDR(发现错误率)过滤，获得可信的鉴定肽段，再将可信的鉴定肽段依据构建的数据库进行蛋白的归并，并对归并后的蛋白进行蛋白水平的FDR过滤，获得可信的鉴定蛋白。根据本专利技术，步骤(3)所述数据分析具体包括：1)利用与所述多克隆抗体相同来源的抗体免疫组库的二代高通量测序结果进行参考数据库的构建，通过核酸序列翻译得到氨基酸序列；2)根据该氨基酸序列构建诱导库；3)将氨基酸序列和诱导库合并作为下游数据分析的数据库；4)采用Percolator软件对鉴定肽段进行谱图水平的1％的FDR过滤，获得可信的鉴定肽段，再将可信的鉴定肽段依据构建的数据库进行鉴定蛋白的归并，并对归并后的蛋白进行蛋白水平的FDR过滤，获得可信的鉴定蛋白；5)统计分析，得到可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样本处理：将待测蛋白样本采用多酶串联酶解处理；(2)液质联用检测：将酶解处理后的肽段进行液相色谱分离和质谱检测；(3)数据分析：质谱原始下机数据过滤，依据构建的数据库对质谱数据进行搜库鉴定，获得鉴定肽段信息，依据鉴定肽段信息归并获得可信的待测蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样本处理：将待测蛋白样本采用多酶串联酶解处理；(2)液质联用检测：将酶解处理后的肽段进行液相色谱分离和质谱检测；(3)数据分析：质谱原始下机数据过滤，依据构建的数据库对质谱数据进行搜库鉴定，获得鉴定肽段信息，依据鉴定肽段信息归并获得可信的待测蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述待测蛋白为多克隆抗体；优选地，所述多克隆抗体经过抗原亲和纯化。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述多酶串联酶解处理具体包括：(a)初步酶解；(b)SDS胶分离目标蛋白和/或肽段；(c)串联酶解步骤(b)中的目标蛋白和/或肽段；优选地，步骤(a)中所述酶为胃蛋白酶和/或木瓜蛋白酶；优选地，步骤(b)所述的目标蛋白和/或肽段为抗体的可变区。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述串联酶解具体包括：采用不同酶组合对抗体的可变区片段进行串联酶解；优选地，所述不同酶组合为两种或两种以上酶依次酶切；优选地，所述串联酶解的酶切顺序为酶切位点越少的酶放在越前面进行酶解。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述串联酶解具体酶切顺序依次为金黄色葡萄菌V8蛋白酶、胰蛋白酶。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述数据库的构建具体包括：1)利用二代高通量测序结果进行参考数据库的构建，得到氨基酸序列；2)根据该氨基酸序列构建诱导库；3)将氨基酸序列和诱导库合并作为下游数据分析的数据库；优选地，所述二代高通量测序结果为利用与所述多克隆抗体相同来源的抗体免疫组库的二代高通量测序结果。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述过滤具体包括：采用Percolator软件对鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：任艳，何燕斌，任哲，邹婉婷，李新洋，丁权，刘斯奇，杨乃波，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44