GPR65蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用及评估方法技术

本发明专利技术提供了GPR65蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用及评估方法，本发明专利技术首次将GPR65蛋白作为评估脑胶质母细胞瘤患者预后的分子标志物，利用免疫组化方法测定脑胶质母细胞瘤组织中GPR65蛋白的表达水平，依据GPR65蛋白在细胞浆中相对表达量的综合评分对脑胶质母细胞瘤患者预后情况进行判断，为评估脑胶质母细胞瘤复发风险及患者术后的生存时间提供了全新的途径。

【技术实现步骤摘要】
GPR65蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用及评估方法
本专利技术属于生物
，特别是涉及肿瘤预后领域，具体为GPR65蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用及评估方法。
技术介绍
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤，按病理及临床特点可分为I至IV级，其中胶质母细胞瘤(GBM)是脑胶质瘤中恶性程度最高的亚型。由于胶质母细胞瘤侵袭性生长，近年来尽管在以标准化治疗为基础的多重治疗方面取得了一些进展，但胶质母细胞瘤患者的总体预后仍未有明显改善，肿瘤极易复发或恶性进展，患者面临致死性病程。目前，脑胶质母细胞瘤患者预后评估主要依赖于临床因素，如发病年龄、KPS评分、手术切除范围和分子标记物特征。然而，经典的病理形态学方法仍是目前脑胶质母细胞瘤诊断、分类的主要方法，难以完整全面的反应肿瘤的生物学行为，对患者的预后判断和术后治疗指导作用有限。本领域迫切需要寻找能区分胶质母细胞瘤分子亚型及准确判断患者预后的相关基因和/或蛋白，这方面的研究对脑胶质母细胞瘤的预后判断、分子分型及个体化治疗具有重要意义。GPR65(G-protein-coupledreceptors65，Genbank号：NM_003608)为G-蛋白偶联受体(GPCRs)家族中的一个重要成员，隶属于GPR4亚家族，是一类敏感的质子传感器。既往研究显示恶性肿瘤细胞生长代谢迅速，造成氧乏进入糖酵解途径产能，含有大量乳酸的代谢产物堆积，使得肿瘤细胞周围形成微酸性环境。GRP65能够感受这种细胞外环境中pH的变化，及时调整下游能量代谢和协调炎症反应、免疫应答等过程，从而使肿瘤细胞获得更多的生存优势，促进肿瘤细胞增殖。目前已在肾癌、结肠癌及卵巢癌等多种恶性肿瘤中发现GPR65高表达，与正常脑组织相比，脑胶质母细胞瘤组织中GPR65表达也显著上调，GPR65蛋白的高表达与脑胶质母细胞瘤患者的较短生存期及无进展生存期显著相关。目前尚无GPR65蛋白应用于脑胶质母细胞瘤的相关文献报道。
技术实现思路
本专利技术的所要解决的技术问题在于提供GPR65蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用，并提供脑胶质母细胞瘤预后评估的方法，更加准确地判断脑胶质母细胞瘤患者预后情况，以便给予更加及时、合理的术后个体化治疗。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案如下：本专利技术经过研究，首次发现，通过免疫组化技术检测脑胶质母细胞瘤组织中GPR65蛋白的相对表达量，能够判断脑胶质母细胞瘤患者的生存预后。基于GPR65蛋白的相对表达量与脑胶质母细胞瘤患者生存预后的这种相关性，以GPR65蛋白作为预后分子标志物对其表达量进行检测，可以用于指导脑胶质母细胞瘤患者的预后判断。本专利技术提供的GPR65蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用，以GPR65蛋白作为分子标记，利用GPR65蛋白单克隆抗体或GPR65蛋白多克隆抗体，结合免疫组化试验试剂，采用免疫组化方法检测GPR65蛋白在脑胶质母细胞瘤组织中的相对表达量，即本专利技术提供了检测GPR65蛋白表达量的试剂在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用。本专利技术还提供一种脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒，该试剂盒包含检测脑胶质母细胞瘤组织样本中GPR65蛋白相对表达量的试剂。进一步，所述的检测脑胶质母细胞瘤组织样本中GPR65蛋白相对表达量的试剂包括GPR65蛋白抗体以及与GPR65蛋白相对表达量检测相配套的试剂。再，所述的GPR65蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，例如：兔抗人GPR65多克隆抗体，ab72157，Abcam；兔抗人GPR65单克隆抗体，2030-1-AP，Proteintech；或兔抗人GPR65单克隆抗体，GTX70559，GeneTex。本专利技术所述的GPR65蛋白相对表达量检测为免疫组化检测方法，与免疫组化检测相配套的试剂包括：二甲苯、乙醇、H2O2体积分数为1-3％的H2O2-甲醇液、BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、PBS、0.1MEDTA抗原修复缓冲液。通过免疫组化检测实验，能够通过染色强度和染色阳性细胞的个数对每个检测样本中的GPR65蛋白的相对表达量进行直观分析。本专利技术所述的一种脑胶质母细胞瘤预后的评估方法，具体包括以下步骤：1)取脑胶质母细胞瘤组织样本，制成石蜡切片；2)利用所述GPR65蛋白抗体以及与免疫组化检测相配套的试剂，进行免疫组织化学染色；3)光镜下观察脑胶质母细胞瘤组织染色情况，进行免疫组化评分；评分方法及标准为：每个样本随机选择至少3个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，以细胞浆内出现黄/棕/褐色为阳性细胞；按照染色强度，分为四个等级：无染色记为0分，浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分；按照阳性细胞个数所占比例，分为四个等级：无阳性细胞记为0分，阳性细胞比例＜25％记为1分，25-75％记为2分，＞75％记为3分；以染色强度的积分乘以阳性细胞个数所占比例的积分，即为该样本点中GPR65蛋白在相应肿瘤组织中相对表达量的综合评分，每个视野内总和评分求平均值后即为该样本中GPR65蛋白在相应肿瘤组织中相对表达量的综合评分，积分范围为0-9分；根据免疫组化评分结果，将样本分为GPR65蛋白高表达组或GPR65蛋白低表达组；GPR65蛋白在细胞浆中相对表达量的综合评分＜5分，记为低表达组；＞5分，记为高表达组；4)通过GPR65蛋白在相应肿瘤组织中相对表达量的综合评分评估胶质母细胞瘤患者的生存预后情况。进一步，本专利技术中，当GPR65蛋白在细胞浆中相对表达量的综合评分＜5分时，脑胶质母细胞瘤患者预后较好即术后总生存期和无进展生存期较长；当GPR65蛋白在细胞浆中相对表达量的综合评分＞5分时，脑胶质母细胞瘤患者预后差即术后总生存期和无进展生存期短。本专利技术对于临床的指导作用在于：对于综合评分大于5分的患者，提示患者临床预后差，术后更易复发，总生存期短，需要连续监测，密切随访，进行高频率的头颅磁共振复查，为脑胶质瘤母细胞的个体化治疗提供依据。同时，GPR65蛋白也可能为脑胶质母细胞瘤的分子靶向治疗提供一个新的靶点。本专利技术的有益效果：本专利技术首次将GPR65蛋白作为评估脑胶质母细胞瘤患者预后的分子标志物，利用免疫组化方法测定脑胶质母细胞瘤组织中GPR65蛋白的表达水平，依据GPR65蛋白在细胞浆中相对表达量的综合评分对脑胶质母细胞瘤患者预后情况进行判断，主要是对患者手术后脑胶质母细胞瘤复发风险及总生存期进行预测，具体的，当免疫组化综合评分＞5分时，脑胶质母细胞瘤患者术后更易复发，总生存期短，易较早到达死亡终点。因此，本专利技术更加准确地实现了对脑胶质母细胞瘤患者预后情况的判断，为评估脑胶质母细胞瘤复发风险及患者术后的生存时间提供了一条全新的途径，对于脑胶质母细胞瘤的预后判断、分子分型及个体化治疗具有重要意义。本专利技术所采用的GPR65蛋白相对表达量的检测方法实质上是肿瘤组织切片的免疫组化定量检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点。附图说明图1为本专利技术实施例1中GPR65蛋白在正常脑组织中的免疫组化染色结果图。图2为本专利技术实施例1中GPR65蛋白在脑胶质母细胞瘤组织中免疫组化染色结果图。图3为本专利技术实施例1中GPR65蛋白在正常脑组织和脑胶质母细胞瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.GPR65蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.GPR65蛋白在制备脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒包含检测脑胶质母细胞瘤组织样本中GPR65蛋白相对表达量的试剂。3.一种脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测脑胶质母细胞瘤组织样本中GPR65蛋白相对表达量的试剂。4.根据权利要求3所述的脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒，其特征在于，所述的检测脑胶质母细胞瘤组织样本中GPR65蛋白相对表达量的试剂包括GPR65蛋白抗体以及与GPR65蛋白相对表达量检测相配套的试剂。5.根据权利要求4所述的脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒，其特征在于，所述的GPR65蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。6.根据权利要求4所述的脑胶质母细胞瘤预后评估试剂盒，其特征在于，所述GPR65蛋白相对表达量检测为免疫组化检测方法，与免疫组化检测相配套的试剂包括：二甲苯、乙醇、H2O2体积分数为1-3％的H2O2-甲醇液、BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、PBS、0.1MEDTA抗原修复缓冲液。7.一种脑胶质母细胞瘤预后的评估方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取脑胶质母细胞瘤组织样本，制成石蜡切片；2)利用GPR65蛋白抗体以及与免疫组化检测相配套的试剂，对石蜡切片进行免疫组化染色；3)光镜下观察脑胶质母细胞瘤组织染色情况，进行免疫组...

【专利技术属性】
技术研发人员：李峰，黄麒霖，陈菊祥，严勇，徐涛，王洪祥，龚振宇，洪帆，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：上海,31