核酸合成方法技术

本发明专利技术涉及核酸合成领域。具体地，本发明专利技术涉及使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有起始核酸分子的固体支持物依次浸泡在含有反应试剂、终止试剂、切除试剂、洗涤试剂的不同的反应容器中以实现核酸合成。

【技术实现步骤摘要】
核酸合成方法
本专利技术涉及核酸合成领域。具体地，本专利技术涉及使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有起始核酸分子的固体支持物依次浸泡在不同的反应容器中以实现核酸合成。
技术介绍
随着基因组研究的深入，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。近来，核酸合成技术越来越受到人们的重视。目前，基本上所有的人工合成DNA都是使用30多年前开创的核苷亚磷酰胺方法生产。经过数十年的液体处理的微调和改进之后，实践中亚磷酰胺基寡核苷酸合成的上限现在约为200-300nt。在此基础上，各大商业公司开发了各自不同的技术，并推出了一些商业化的机器。这些合成仪大体可以分为两种：柱式合成仪和微阵列合成仪。柱式合成仪以Dr.oligo192和mermade为代表,通过电磁阀控制试剂的添加，在尺寸为厘米级别的多孔反应柱上进行固相合成反应。该方法错误率较低，但是合成通量不高而且所需物料也较多。微阵列合成仪以CustomArray合成仪为代表，是将合成反应缩小到微米级别的反应孔内，一张芯片上有上万个反应孔，这样虽然提高了合成通量也一定程度上减少了原料的消耗，然而产量低，电化学反应不易控制，且错误率较高。另外，从进样方式上看，柱式和微阵列核酸合成仪均为将合成试剂通过预先铺设的管线加到合成柱或者合成芯片上，且加入的试剂大大过量，这就造成了试剂的极大浪费和低物料使用率。近期，科学家们描述了使用模板非依赖性聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的寡核苷酸合成策略(见WO2017223517A1)，其方法为：每个TdT分子与单个可掺入起始核酸分子的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)分子偶联形成TdT-dNTPconjugates，TdT分子与dNTP通过一个可切割的基团连接。在延伸过程中，起始核酸分子的3'末端保持与TdT-dNTP共价结合并且不能与其他TdT-dNTP分子接触。在去保护过程中，用切除试剂切割TdT和掺入的核苷酸之间的连接子，从而释放合成的核酸分子并允许继续进行随后的延伸。在现有的固相核酸合成方法中，是将合成试剂通过预设的合成柱、合成芯片或者合成磁珠上，需要加入过量的试剂，反应不完全，会造成试剂的极大浪费。因此，本领域迫切需要新的高通量的、低成本的核酸合成方法。
技术实现思路
针对现有核酸合成方法存在的问题，本专利技术提供了使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有起始核酸分子的固体支持物依次浸泡在含有不同试剂的反应容器中以实现核酸合成。本专利技术通过生化试剂重复利用、大幅度提高了通量，从而降低了核酸合成的成本。如本文所用的术语“浸泡式反应方案”意指在核酸合成的过程中，固定有起始核酸分子的固体支持物移动至与反应试剂接触，而非使用流动通道使反应试剂移动至与固定在固相载体上的核酸接触。所述浸泡式反应方案至少具有以下优势：1.生化试剂重复利用；2.扩展性好，使用灵活，能够大幅提高通量；3.不需要复杂的温度和流体控制系统，反应较均匀；4.显著降低核酸合成成本。在本文所述的方法中，核酸合成可以利用多种固体支持物(即固相载体)实现，其实例包括但不限于芯片、磁珠、柱。在一些实施方案中，核酸合成的过程可以是自动化过程。应当理解，任何已知的固相核酸合成过程都可以结合到本文所述的浸泡式反应方案中。在一个实施方案中，本专利技术提供了使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，包括以下步骤：a.提供其上固定有起始核酸分子的固体支持物，b.将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器中，使所述起始核酸分子与TdT-dNTP充分反应，生成第一延伸产物；c.将固体支持物浸泡在置于第二反应容器中的终止试剂中，以终止反应；d.将固体支持物浸泡在置于第三反应容器中的切除试剂中，或将固体支持物暴露于光，以从第一延伸产物上切除TdT；e.将固体支持物浸泡在置于第四反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到延伸后的核酸分子；f.任选地，重复步骤b至e。在另一个实施方案中，本专利技术提供了使用浸泡式反应方案同时进行多个核酸分子合成的方法，包括以下步骤：a.提供其上固定有起始核酸分子的多个固体支持物，b.将所述多个固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器中，使所述起始核酸分子与TdT-dNTP充分反应，生成第一延伸产物；c.将所述多个固体支持物浸泡在置于第二反应容器中的终止试剂中，以终止反应；d.将所述多个固体支持物浸泡在置于第三反应容器中的切除试剂中，或将所述多个固体支持物暴露于光，以从第一延伸产物上切除TdT；e.将所述多个固体支持物浸泡在置于第四反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到延伸后的核酸分子；f.任选地，重复步骤b至e。如本文所使用的，“含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器”意指含有反应试剂TdT-dATP、TdT-dTTP、TdT-dCTP、TdT-dGTP、TdT-dUTP中的任一种的第一反应容器。即，在合成DNA/RNA分子的过程中，需至少准备4种含有反应试剂TdT-dNTP的反应容器。根据意欲合成的核酸分子的序列，在步骤b中将所述固体支持物浸泡在含有相应反应试剂TdT-dNTP的反应容器中。例如，意欲合成的核酸分子的第一个核苷酸是A，则在步骤b中将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dATP的反应容器中；意欲合成的核酸分子的第二个核苷酸是T，则在第二次进行步骤b时将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dTTP的反应容器中，以此类推。在一个实施方案中，步骤b至e可重复一次或多次，例如重复1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多次。在某些实施方案中，洗涤通过将固体支持物浸泡在包含洗涤溶液的反应容器中进行。如本文所用，所述“浸泡”包括使得固体支持物上固定的核酸分子与反应容器中的试剂或溶液接触的任何方式。固体支持物可以例如以垂直、倾斜或水平的方式部分或全部浸泡在反应容器中，条件是固体支持物上固定的所有核酸分子与反应容器中的试剂充分接触。如本文所用的“起始核酸分子”是指用于核酸固相合成的起始分子。如本领域技术人员理解，核酸固相合成需要至少3-5个碱基的起始核酸分子(或称为“起始底物”，“起始引物”)来启动合成。然后可以将该初始分子逐个核苷酸延伸，生成所需核酸产物。在一些实施方案中，起始核酸分子可以是使用亚磷酰胺方法合成的寡核苷酸引物。在一些情况下，起始核酸分子的特定序列可用于合成的核酸的下游应用。在一些实施方案中，可以在合成完成后从合成的核酸中除去起始核酸分子的序列，特别是如果起始核酸分子在其3'末端附近包含可切割的连接。例如，如果起始核酸分子是具有3'末端脱氧尿苷的引物，则通过将延伸后的引物暴露于USEREnzyme(即尿嘧啶DNA糖基化酶和内切核酸酶VIII的混合物)可将合成的序列从起始引物切割下来。可以使用其他可切割的连接，例如，引物中的桥接硫代磷酸酯，可用银或汞离子切割。本申请中使用的术语“核酸”可以是任何类型的核酸，例如核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物，其可以与“多核苷酸”互换使用。核酸可以是单链的、双本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，包括以下步骤：a.提供其上固定有起始核酸分子的固体支持物，b.将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT‑dNTP的第一反应容器中，使所述起始核酸分子与TdT‑dNTP充分反应，生成第一延伸产物；c.将固体支持物浸泡在置于第二反应容器中的终止试剂中，以终止反应；d.将固体支持物浸泡在置于第三反应容器中的切除试剂中，或将固体支持物暴露于光，以从第一延伸产物上切除TdT；e.将固体支持物浸泡在置于第四反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到延伸后的核酸分子；f.任选地，重复步骤b至e。

【技术特征摘要】
1.一种使用浸泡式反应方案进行核酸合成的方法，包括以下步骤：a.提供其上固定有起始核酸分子的固体支持物，b.将所述固体支持物浸泡在含有反应试剂TdT-dNTP的第一反应容器中，使所述起始核酸分子与TdT-dNTP充分反应，生成第一延伸产物；c.将固体支持物浸泡在置于第二反应容器中的终止试剂中，以终止反应；d.将固体支持物浸泡在置于第三反应容器中的切除试剂中，或将固体支持物暴露于光，以从第一延伸产物上切除TdT；e.将固体支持物浸泡在置于第四反应容器中的洗涤试剂中进行洗涤、纯化得到延伸后的核酸分子；f.任选地，重复步骤b至e。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应试剂TdT-dNTP选自TdT-dATP、TdT-dTTP、TdT-dCTP、TdT-dGTP、TdT-dUTP中的任一种，根据意欲合成的核酸分子的序列，在步骤b中将所述固体支持物浸泡在含有相应反应试剂TdT-dNTP的反应容器中。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤b至e重复一次或多次，例如重复1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多次。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，还包括：在合成完成后从合成的核酸分子中除去所述起始核酸分子。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述反应试剂TdT-dNTP含有光可切割的接头，在步骤d中将固体支持物暴露于切除试剂后，TdT被切除。6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述反应试剂TdT-dNTP含有化学可切割的接头，在步骤d中将固体支持物暴露于光后，TdT被切除。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中，所述反应容器具有选自下列的一个或多个特征：(a)所述反应容器为能够容纳试剂的装置或容器，例如槽、渠、孔、试管、杯、皿；(b)所述反应容器具有期望的形状，例如方形、球形、锥形、圆柱体形、不规则形状、或其任何组合；(c)所述反应容器具有期望的尺寸，例如能够容纳至少1μL、至少2μL、至少5μL、至少10μL、至少20μL、至少50μL、至少100μL、至少20...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢伟，梁金金，吕伟莹，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44