一种人脐带间充质干细胞无血清培养基制造技术

本发明专利技术提供了一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于包括α‑MEM基础培养基，还包括如下组分：以终浓度计，谷氨酰胺1‑20mM、HEPEs 1‑20mM、腐胺10‑100μM、转铁蛋白0.1‑10μM、维生素C 10‑400μM、重组胰岛素1‑10μM、黄体酮1‑20nM、皮质醇10‑200nM、人血白蛋白1‑20mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1‑10ng/mL、转化生长因子β11‑10ng/mL、螺旋藻速溶蛋白多糖1‑50mg/mL。本发明专利技术提供的人脐带间充质干细胞无血清培养基可显著提高人脐带间充质干细胞的增殖速率和贴壁性能，有利于人脐带间充质干细胞的增殖和干细胞特性的保持，具有成脂、成骨诱导分化潜能。培养基成分简单、明确、稳定，不含任何血清组分，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险，安全性高。

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞无血清培养基
本专利技术属于干细胞培养
，具体涉及一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的配方及其应用。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)是来源于早期中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是造血微环境中的一种重要的细胞成分，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化，而且免疫原性弱，是组织工程立项的种子细胞来源。人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)来源于新生儿脐带中的华通氏胶，除具有MSCs的所有特性外，还具有含量丰富，细胞纯净，免疫原性更低，细胞原始、分化能力更强，无伦理限制等优势，可为实验和临床提供充足的细胞来源，具有广阔的临床应用前景。现有的用于培养hUC-MSCs的培养基主要分为三类。一类是基础培养基中添加动物血清，弊端是无法规避动物血清中的异源体，可能存在人体异种蛋白污染或过敏，风险较大；第二类是基础培养基中添加人血小板裂解液之类的血清替代物，但是同样有成分不明的蛋白存在，批次差异较大，来源不稳定等缺点。第三类是基础培养基中添加化学组分明确的血清替代成分，这既满足了hUC-MSCs的培养要求，又有效避免了前两类培养基的诸多不利因素。因此，适合hUC-MSCs细胞生长的化学配方确定的细胞培养基是干细胞走向临床的重要条件。然而，目前市面上正在销售的商品化MSCs无血清培养基，无论是国外进口还是国内研发生产，不仅价格昂贵，细胞培养的效果也不理想。与血清培养体系相比细胞状态差、细胞贴壁性差、操作繁琐、细胞增殖速率不够，而且细胞老化速度快，MSCs的分化能力降低。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，专利技术人通过反复的实验验证，获得了一种新的人脐带间充质干细胞无血清培养基，可以有效的对脐带间充质干细胞进行培养。本专利技术所提供的人脐带间充质干细胞无血清培养基，是使用α-MEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺1-20mM、HEPEs1-20mM、腐胺10-100μM、转铁蛋白0.1-10μM、维生素C10-400μM、胰岛素1-10μM、黄体酮1-20nM、皮质醇10-200nM、人血白蛋白1-20mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1-10ng/mL、转化生长因子1-10ng/mL、速溶蛋白多糖1-50mg/mL。所述的速溶蛋白多糖是从螺旋藻中提取的一种水溶性多糖，是一种无毒的天然生物活性物质，具有促进细胞生长、提高免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗衰老、对核酸内切酶活性和DNA修复合成有增强作用等功能。所述的速溶蛋白多糖，其制备方法如下：将螺旋藻干粉清洗，加水后在75-90℃下加热，然后冷却至常温，减压过滤分离，用盐酸调节滤液pH值至3-5，放置12-36h，4000rpm，离心15min离心；分离得到的上清液用Na2CO3溶液调节pH至7.0，然后喷雾干燥，得到藻蛋白多糖提取物。优选的，本专利技术提供的一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，包括α-MEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺5mM，HEPEs7mM，腐胺60μM、转铁蛋白1μM、维生素C200μM、胰岛素6μM、黄体酮20nM、皮质醇110nM、人血白蛋白6mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子2ng/mL、转化生长因子4ng/mL、速溶蛋白多糖5mg/mL。优选地，所述胰岛素为重组胰岛素，所述转化生长因子为转化生长因子-β1，所述速溶蛋白多糖来源于螺旋藻。相应地，本专利技术还提供人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：向α-MEM基础培养基中，按所述浓度加入谷氨酰胺、HEPEs、腐胺、转铁蛋白、维生素C、胰岛素、黄体酮、皮质醇、人血白蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、速溶蛋白多糖，混匀，经0.2μm滤膜过滤除菌，得到人脐带间充质干细胞的无血清培养基。与现有技术相比，采用以上技术方案配制的人脐带间充质干细胞无血清培养基培养脐带间充质干细胞，具有以下优势：1.因为没有添加动物来源的血清，所以可以控制感染的风险；2.所含组分均来自重组蛋白或化学合成，不会引起人体免疫排斥；3.操作简单，不需要提前对培养皿或培养瓶进行包被；4.细胞贴壁性好，细胞形态佳；5.细胞增殖速率高，干细胞特性保持佳。附图说明图1三种不同培养基(A、B、C)培养的人脐带间充质干细胞至汇合的对比图(P3代)；图2三种不同培养基(A、B、C)培养的人脐带间充质干细胞增殖曲线的对比图；图3三种不同培养基(A、B、C)培养的P5代人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化染色结果图；图4三种不同培养基(A、B、C)培养的P5代人脐带间充质干细胞的成骨诱导分化染色结果图；其中：A培养基为DMEM-LG基础培养基+10％体积百分比的FBS(Gibco)；B培养基为α-MEM基础培养基+10％血小板裂解液C培养基为实施例1中提供的人脐带间充质干细胞无血清培养基。具体实施方法下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。本专利技术中的各组分可选用常规市售产品，例如黄体酮购自sigma，货号为V900699。实施例1人脐带间充质干细胞无血清培养基配比的筛选制备方法：向α-MEM基础培养基中，按所述浓度加入谷氨酰胺母液、HEPEs母液、腐胺、转铁蛋白母液、维生素C母液、胰岛素母液、黄体酮母液、皮质醇母液、人血白蛋白母液、碱性成纤维细胞生长因子母液、转化生长因子母液、速溶蛋白多糖母液，搅拌混匀，经0.2μm滤膜过滤除菌即得。谷氨酰胺母液：取0.5g，用三蒸水溶解，配成200mM的母液，-20℃保存。重组转铁蛋白母液的制备：取50mg，用α-MEM基础培养基溶解，配成1mM的母液，-20℃保存。维生素C母液的制备：取1g，用α-MEM基础培养基溶解，配成50mg/ml的母液，-20℃保存。重组人胰岛素母液的制备：取20mg，用pH3的盐酸溶解，配成1mg/ml的母液，-20℃保存。黄体酮母液的制备：取5g，用乙醇溶解，配成1mM的母液，-20℃保存。碱性成纤维细胞生长因子母液的制备：取10μg，用PBS溶解，配成10μg/ml的母液，-20℃保存。转化生长因子母液的制备：取2μg，用PBS溶解，配成2μg/ml的母液，-20℃保存。速溶蛋白多糖的提取：将螺旋藻干粉1kg用1L水冲洗，抽滤，向滤渣中加入10L水搅拌，在88℃下加热1h，冷却后常温后，减压过滤分离，用盐酸调节滤液pH值至3.8，放置过夜，4000rpm离心15min，分离获得的上清液用Na2CO3溶液调节pH至7，然后喷雾干燥，得到藻蛋白多糖提取物粗品(淡黄色粉末，无毒，可溶于水)200g，测定提取物中蛋白多糖含量为72.3％。设计如下正交试验，对人脐带间充质干细胞无血清培养基中转化生长因子、人血白蛋白、速溶蛋白多糖的配比进行筛选，筛选过程中使用P3代复苏后传代的人脐带间充质干细胞，详细设计见表1。表1正交试验设计探究人脐带间充质干细胞无血清培养基的配比结果发现：人脐带间充质干细胞无血清培养基，如下配比培养的人脐带间充质干细胞形态、增殖最佳。该培养基包括α-MEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺5mM，HEP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的无血清培养基是包括如下浓度组分的α‑MEM基础培养基：谷氨酰胺1‑20mM、HEPEs 1‑20mM、腐胺10‑100μM、转铁蛋白0.1‑10μM、维生素C 10‑400μM、胰岛素1‑10μM、黄体酮1‑20nM、皮质醇10‑200nM、人血白蛋白1‑20mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1‑10ng/mL、转化生长因子1‑10ng/mL、速溶蛋白多糖1‑50mg/mL。

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的无血清培养基是包括如下浓度组分的α-MEM基础培养基：谷氨酰胺1-20mM、HEPEs1-20mM、腐胺10-100μM、转铁蛋白0.1-10μM、维生素C10-400μM、胰岛素1-10μM、黄体酮1-20nM、皮质醇10-200nM、人血白蛋白1-20mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1-10ng/mL、转化生长因子1-10ng/mL、速溶蛋白多糖1-50mg/mL。2.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述的速溶蛋白多糖的制备方法如下：将螺旋藻干粉清洗，加水后在75-90℃下加热，然后冷却至常温，减压过滤分离，用盐酸调节滤液pH值至3-5，放置12-36h，4000rpm，离心15min离心；分离得到的上清液用Na2CO3溶液调节pH至7.0，然后喷雾干燥，得到藻蛋白多糖提取物。3.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉娟，徐矫健，葛淑娟，刘燕丽，
申请(专利权)人：青岛麦迪赛斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37