一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌及其构建方法，为敲除fruA、gcd基因的类球红细菌2.4.1工程菌株，是通过用连接有fruA‑LR、gcd‑LR序列的载体pK18mobsacB::fruA‑LR、pK18mobsacB::gcd‑LR敲除fruA、gcd基因获得；所述类球红细菌菌株消耗单位质量的葡萄糖益于获得更多菌体细胞，降低生产成本，显现出良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌及其构建方法
本专利技术涉及类球红细菌生产领域，尤其是一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌及其构建方法。
技术介绍
类球红细菌富含多种营养药用成分，具有抗脂质过氧化、抗辐射、抗肿瘤、调节机体免疫等功能，在食品、医药领域有了新应用。可从菌体中提取辅酶Q10、番茄红素、维生素B12、超氧化物歧化酶等营养药用成分。目前利用类球红细菌发酵辅酶Q10已实现产业化。随着研究的深入，该菌在食品、医药领域更多潜在的功用将被挖掘出来，获取大量的菌体细胞对生产上述营养药用成分具有重要意义。葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛。在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质，因此在微生物生长过程中，高效利用葡萄糖对其生长具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，为敲除fruA、gcd基因的类球红细菌(类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)2.4.1工程菌株。优选的，上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，是通过用连接有fruA-LR、gcd-LR序列的载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR敲除fruA、gcd基因获得的。该方法实现了特异性无缝敲除，且效率高、稳定，可重复得到完全相同的类球红细菌工程菌。上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌特异性无缝敲除fruA、gcd基因的具体构建方法：所用宿主菌为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)2.4.1，所述载体为pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR；敲除载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR化转至大肠S17-1感受态中，再通过接合转移的方法，将含有敲除载体的S17-1与类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)2.4.1共同培养，敲除载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR将会被导入至类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)2.4.1，而后，发生左右臂同源交换获得敲除菌株，同源重组原理见图8，提取基因组进行验证，如果fruA基因敲除，通过PCR验证，将会扩增出2015bp大小的片段，如果gcd基因敲除，通过PCR验证，将会扩增出1815bp大小的片段，即获得fruA和gcd基因双敲除的类球红细菌菌株。优选的，上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，所述载体pK18mobsacB::fruA-LR中包括fruA左臂右臂1819bp重叠序列fruA-LR，其中，类球红细菌中fruA左臂979bp序列fruA-L，其基因序列见序列表1、2；fruA右臂834bp序列fruA-R，其基因序列见序列表3、4。优选的，上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，所述fruA左臂基因fruA-L和fruA右臂基因fruA-R通过重叠PCR获得重叠基因fruA-LR，将重叠基因fruA-LR和出发载体pK18mobsacB分别用EcoRI和SalI双酶切后进行连接，构建fruA-LR基因的敲除载体，为pK18mobsacB::fruA-LR，其质粒图谱见图2，PCR验证结果见图3，双酶切验证结果见图4。优选的，上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，所述载体pK18mobsacB::gcd-LR中包括gcd左臂右臂1709bp重叠序列gcd-LR，其中，类球红细菌中gcd左臂770bp基因gcd-L，其基因序列见序列表5、6；gcd右臂976bp基因gcd-R，其基因序列见序列表7、8。优选的，上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，所述gcd左臂基因gcd-L和gcd右臂基因gcd-R通过重叠PCR获得重叠基因gcd-LR，将重叠基因gcd-LR和出发载体pK18mobsacB分别用EcoRI和SalI双酶切后进行连接，构建gcd-LR基因的敲除载体，为pK18mobsacB::gcd-LR，其质粒图谱见图5，PCR验证结果见图6，双酶切验证结果见图7。上述获得fruA和gcd基因双敲除的类球红细菌菌株，与野生型菌株差异性比较，测定其生长曲线、葡萄糖消耗速率等。上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌所需培养基如下：NH1液体培养基：8g/L酵母提取物,3g/L葡萄糖,2g/LNaCl,1.3g/LKH2PO4,0.125g/LMgSO4,1mg/L盐酸硫胺,15μg/L生物素,1mg/L烟酸,用NaOH调节pH至7.2，115℃灭菌20分钟。固体培养基加入1.5％的琼脂。NH1+kana液体培养基：NH1液体培养基基础上，加入卡那霉素，卡那霉素终浓度为25μg/mL。SMM培养基：葡萄糖8g/L，K2HPO43.5g/L，(NH4)2SO40.5g/L，NaCl0.5g/L，KOH2g/L，CB母液20mL/L，生长因子母液1mL/L，调节pH至6.9。CB母液：在500ml的去离子水中加入l0g氨三乙酸和8gKOH，待全部溶解后依次加入14.6g无水硫酸镁，1.7gCaCl2·2H2O，50mLM44母液。M44母液：2g/LEDTA，11g/LZnS·7H2O，5g/LFeSO4·7H2O，1.5g/LMnSO4·H2O，0.4g/LCuSO4·5H2O，0.12/LgH3BO3，0.37g/LCoCl4·6H2O。生长因子母液：在100ml去离子水中加入4mg生物素，200mg烟酸，100mg盐酸硫胺素，定容至200ml，过滤除菌。SMM+10％sucrose固体培养基：在SMM培养基中加入l00g/L的蔗糖，15g/L的琼脂，115℃灭菌20min。上述高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌所需发酵条件：100mL发酵液，接种量2％，30℃，pH6.9，转速200rpm。上述培养基均可采用标准方法制备获得。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过基因改造改变菌株葡萄糖代谢途径，获得一株能高效利用葡萄糖的类球红细菌菌株,相比野生型菌株，消耗单位质量的葡萄糖益于获得更多菌体细胞，降低生产成本，显现出良好的应用前景。具体来说，本专利技术利用同源重组技术将类球红细菌中的葡萄糖PTS转运蛋白IIBC和周质葡萄糖脱氢酶编码基因进行无缝敲除，获得fruA和gcd基因双敲除的高效利用葡萄糖类球红细菌工程菌重组菌。本专利技术将fruA、gcd基因双敲除的重组菌以葡萄糖为唯一碳源化学合成培养基进行发酵分析，检测发酵液中的细胞浓度和葡萄糖浓度，发现最大生物量约是野生株的1.3倍，fruA和gcd敲除后单位菌体干重对葡萄糖得率达到0.62g/g，比野生株提高31％。本专利技术显著提高类球红细菌菌体干重对葡萄糖得率，益于获得更多菌体细胞，降低生产成本。其中，1、本专利技术利用同源重组技术获得fruA、gcd的基因敲除菌株，不用插入筛选标记，无缝定点敲除fruA、gcd基因，不影响其上游和下游本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：为敲除fruA、gcd基因的类球红细菌2.4.1工程菌株。

【技术特征摘要】
2017.10.31 CN 20171103795731.一种高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：为敲除fruA、gcd基因的类球红细菌2.4.1工程菌株。2.根据权利要求1所述的高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：是通过用连接有fruA-LR、gcd-LR序列的载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR敲除fruA、gcd基因获得的。3.根据权利要求2所述的高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌，其特征在于：高效利用葡萄糖的类球红细菌工程菌特异性无缝敲除fruA、gcd基因的具体构建方法为：所用宿主菌为类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)2.4.1，所述载体为pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR；敲除载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR化转至大肠S17-1感受态中，再通过接合转移的方法，将含有敲除载体的S17-1与类球红细菌2.4.1共同培养，敲除载体pK18mobsacB::fruA-LR、pK18mobsacB::gcd-LR将会被导入至类球红细菌2.4.1，而后，通过提取基因组进行验证，如果fruA基因敲除，通过PCR验证，将会扩增出2015bp大小的片段，如果gcd基因敲除，通过PCR验证，将会扩增出1815bp大小的片段，即获得fruA和gcd基因双敲除的类球红细菌菌株。...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡佳佳，亓正良，刘浩，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12