一株地衣芽孢杆菌及其在防治便秘上的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YHSH‑02及其在防治便秘上的应用，该菌种已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．15454，保藏日期为2018年3月15日。本发明专利技术不仅扩大了地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YHSH‑02的应用范围，提高了其应用价值，而且给便秘的防治带来了更好的效果。

【技术实现步骤摘要】
一株地衣芽孢杆菌及其在防治便秘上的应用
本专利技术属于微生物
，涉及一株地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisYHSH-02及其在防治便秘上的应用。
技术介绍
便秘是指各种原因引起的排便困难、排便次数减少、或排便不尽感，可分为功能性便秘和继发便秘两类。便秘的发生可能与饮食中纤维素含量少、液体量摄入不足、遗传易感、胃肠运动、胃肠激素、环境影响、精神心理等多种因素有关。现代先进技术大量运用于便秘这种常见疾病的研究加深了人们对于其发病原因发病机制的认识。西医对于便秘的诊断较为明确，治疗方法主要采用口服药物治疗，常用药物包括容积性泻剂、刺激性泻剂、渗透性泻剂、润滑性泻剂、促动力药物等。这些药物对于缓解便秘近期疗效令人满意，但是远期疗效相对较差。部分药物长期不合理使用容易导致不良反应，如葱酮类药物长期使用可致水、电解质失去和结肠功能障碍，还可造成患者对药物的依赖性;盐类泻药中的镁离子大约20%可被肠道吸收，肾功能障碍病人或中枢抑制的病人可能发生毒性反应。中医治疗功能性便秘具有中医的特色和优势，但是常用的中药（如大黄，番泻叶，芦荟等含有恩醌类的刺激性泻药），这些药物对于缓解便秘近期疗效令人满意，但是远期疗效相对较差。长期使用普遍疗效不佳，而且在治疗上忽视本虚标实这一基本病机，有的单纯祛邪，有的单纯补虚，效果不理想。近年来功能性便秘的治疗有了新的发展，出现了心理疗法、生物反馈治疗等方法，临床上颇有疗效，但这些只可作为药物治疗便秘的辅助手段。近年来，对益生菌的研究和应用越来越广泛，在人类健康中起了非常重要的作用。地衣芽孢杆菌是一种产芽孢、兼性需氧的革兰氏阳性菌，具有抗逆性强、抑菌谱广、代谢产物丰富等特点，作为益生菌添加在饲料中，通过抑制病原菌粘附、生物夺氧、拮抗病原菌、分泌多种消化酶等，营造健康肠道环境，促进营养物质吸收利用，提高畜禽健康水平。也有应用在肠道腹泻上，但其还没有被应用到防治便秘上，本专利技术通过大量试验发现一株地衣芽孢杆菌，对防治便秘效果非常好的一株动物肠道分离菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisYHSH-02及其在防治便秘上的应用，该菌种已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO．15454，保藏日期为2018年3月15日。其中，地衣芽孢杆菌制剂的制备可以按以下步骤制备（也可以用其它方法制备）：一、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2LLB培养基的5L大三角瓶中，37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为地衣芽孢杆菌液体菌种；二、将步骤一培养的地衣芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，37℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于150亿CFU/ml，即可结束发酵，无菌灌装得到成品地衣芽孢杆菌菌剂；或得到发酵液后加上糊精进行喷雾干燥，得到地衣芽孢杆菌粉剂，其粉剂芽孢含量不低于100亿CFU/g；其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；其中所述发酵培养基：豆粕粉70g/L，玉米浆粉10g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.2；加0.3g/L中性蛋白酶在45℃水解一小时后，再进行灭菌；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。本专利技术所述地衣芽孢杆菌YHSH-02制备的制剂应用是单独应用或与其他药物联合应用到防治便秘上。本专利技术所述地衣芽孢杆菌YHSH-02制备的制剂包括药品、保健食品、食品、饮品。本专利技术所述地衣芽孢杆菌YHSH-02制备的制剂的有效剂量是指地衣芽孢杆菌YHSH-02总活菌数不能低于5×106CFU/g。本专利技术的地衣芽孢杆菌制剂能够有效预防或治疗便秘，明显快速减少便秘症状，且无任何毒副作用，应用依从性好，防治便秘总有效可达100%，治愈率达90%以上，是预防或治疗便秘的新菌株。本专利技术的地衣芽孢杆菌能有效防治便秘可能从下面几个方面起到一定的作用：地衣芽孢杆菌能够影响结肠蠕动速率、抑制致病菌生长，并且能够促进短链脂肪酸的生成短链脂肪酸和乳酸能调节肠道的酸碱度、降低pH，这些因素可能会对结肠蠕动和缓解便秘产生有效的作用。本专利技术的地衣芽孢杆菌YHSH-02能够抑制洛呱丁胺诱导的便秘造成的小鼠粪便重量、颗粒数和含水量下降，且效果优于整肠生地衣芽孢杆菌。（洛哌丁胺具有抑制肠道蠕动、增加粪便排空时间等特性，因此，其诱导的便秘小鼠具有较少粪便粒数、重量等特点。）本专利技术利用肠道推进实验来探索地衣芽孢杆菌YHSH02对肠道蠕动的促进作用。结果显示地衣芽孢杆菌YHSH02组小肠墨汁推进长度能够比便秘模型组至少快1.43倍，提示地衣芽孢杆菌YHSH02能够加快小肠蠕动并具有显著通便效果。本专利技术的地衣芽孢杆菌能够有效提高便秘小鼠粪便短链脂肪酸的含量。主要是可能芽孢杆菌进入小鼠肠道后，快速消耗肠道中的空气或者芽孢杆菌的某些代谢产物，从而促进了肠道中的厌氧菌如乳酵杆菌，丁酸菌的繁殖，从而导致肠道PH下降与短链脂肪酸的增加；能够促进结肠短链脂肪酸的产生，并促进结肠上皮细胞与粘膜损伤的修复。本专利技术的地衣芽孢杆菌可改善胃肠道间质细胞(ICC)的c-kit基因表达，从而增加结肠的蠕动性能，促进排便。具体实施方式实施例1地衣芽孢杆菌的分离2014年12月，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌株是在湖南省隆回县滩头镇野外的野生野猪的肠道内容物中分离得到的。具体方法是：取野生野猪的肠道内容物加入盛有10mL灭菌水的三角瓶中，震荡培养30min(200r/min)，然后取悬浮液1mL置于9mL无菌水中，制成10-2稀释悬浮液，依次类推，制成10-5，10-6稀释悬液；在其中各吸取100uL，加到营养肉汤培养基平板，MRS培养基，PDA培养基上，用涂布棒涂布均匀，每个处理重复3次。将上述培养皿，置于37℃恒温培养箱中培养1-2d（PDA培养基置30℃下培养）。挑选单菌落转接到对应的培养基上培养，长出菌落后，用接种环进行划线分离纯化，纯化菌株于4℃保存。总共分离得到218个形态有差异单菌落。其中的分离、纯化获得的YHSH-02菌株在营养肉汤培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为杏仁白色，湿润有光泽，略有放射状条纹，培养48小时后，培养基上有明显产棕色色素；细胞形状为杆状，细胞大小为0.6um-0.8um×1.5um-3.5um；两端钝圆，形成芽孢，芽孢近椭圆形，中生，具有周生鞭毛，能运动。不形成伴孢晶体；好氧与厌氧都能生长；可液化明胶，水解淀粉，V-P反应、接触酶反应，酪素分解反应，牛奶胨化反应为阳性；卵黄反应，吲哚反应，苯丙氨酸脱氨反应，酪氨酸分解反应，牛奶凝固反应为阴性；能利用葡萄糖，木糖，L-阿拉伯糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YHSH‑02，该菌种已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．15454，保藏日期为2018年3月15日。

【技术特征摘要】
1.一株地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisYHSH-02，该菌种已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO．15454，保藏日期为2018年3月15日。2.按权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在防治便秘上的应用。3.按权...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋常德，蒋常银，林祖端，
申请(专利权)人：佛山市艳晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44