一种Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种Bt蛋白仿生亲和材料，属于化学与材料领域，它是模拟Bt Cry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt‑R1之间的分子识别机制，以人工合成的丙烯酰胺‑多肽‑酰胺单体与其它共存单体反应后得到的聚合物纳米颗粒，所述多肽包含有NITIHITDTNNK的氨基酸序列。本发明专利技术具有昆虫受体类钙粘蛋白Bt‑R1的仿生特点，当其与Bt Cry1Ac蛋白作用时，可以模拟Bt‑R1的识别机理，通过其侧链结构中的NITIHITDTNNK与Bt Cry1Ac蛋白的抗原表位

A Biomimetic Affinity Material of Bt Protein and Its Preparation and Application

The invention discloses a biomimetic affinity material of Bt protein, belonging to the field of chemistry and materials. It simulates the molecular recognition mechanism between Bt Cry1Ac protein and cadherin Bt_R1, a receptor of brush border membrane sac of tobacco moth midgut. The polymer nanoparticles are obtained by reacting the synthesized acrylamide polypeptide amide monomer with other coexisting monomers. The polypeptide contains NITIHITDT. Amino acid sequence of NNK. The invention has the bionic characteristics of insect receptor cadherin Bt_R1. When it interacts with Bt Cry1Ac protein, the recognition mechanism of Bt_R1 can be simulated, and the antigenic epitopes of NITIHITDTNNK and Bt Cry1Ac protein in its side chain structure can be obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法和应用
本专利技术属于化学与材料领域，涉及一种Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法，本专利技术还涉及一种以所述Bt蛋白仿生亲和材料为吸附剂，对土壤Bt蛋白进行提取分离的方法。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)是一种好氧型革兰氏阳性细菌、呈杆状、内生芽孢，是一种重要的杀虫细菌。Bt蛋白是苏云金芽孢杆菌菌体生长进入稳定期，在芽孢周围形成的菱形或者双锥形的伴孢晶体蛋白(parasporalcrystalprotein)，又称为杀虫晶体蛋白(Insecticidalcrystalprotein,ICP)或δ-内毒素。环境和生物介质中Bt蛋白的定性和定量检测方法主要有：生物测定法、凝胶电泳法、免疫检测法(包括酶联免疫吸附测定法，免疫印迹分析法、胶体金免疫层析试纸条法)。酶联免疫吸附测定法是目前应用最广的免疫快速检测方法，具有较高的灵敏度，可同时对大量样本进行检测等优点。该方法首先需要使用缓冲溶液将土壤、叶片或种子中的Bt蛋白提取到水相中，然后再采用试剂盒进行定性分析和定量检测。目前采用的提取方法主要有PBST法、碳酸盐法、SDS提取法以及人造蠕虫肠道蛋白提取法。其中PBST、碳酸盐和SDS提取法的提取效率普遍偏低、而人造蠕虫肠道蛋白提取法则存在提取成本高的问题。尽管酶联免疫吸附法具有较高的灵敏度，但是对于Bt蛋白含量较低、样品基体吸附很强的土壤样品来说，仍然很难避免由于Bt蛋白提取效率低、基质干扰严重所造成的“假阴性”结果。因此，研制出一种对Bt蛋白具有特异性分子识别能力的亲和配体，建立一套有效的分离纯化和样品前处理方法，对于环境和转基因作物中Bt蛋白的有效监控具有十分重要的意义。聚合物纳米颗粒是通过疏水性、亲水性以及带电性功能单体之间的自由基引发聚合得到的，其对目标蛋白的识别机理主要基于聚合物侧链结构中的疏水性、亲水性以及带电荷基团与蛋白质氨基酸侧基之间存在的疏水作用、氢键作用、静电作用、π-π堆积作用、π-阳离子相互作用以及范德华力等。这种结合力与天然生物大分子之间(酶-底物、酶-辅基、抗原-抗体、激素-受体)互补的多重相互作用原理是一致的。因此，可以通过调节功能单体的种类和配比，使合成的聚合物纳米颗粒具有与目标生物大分子相匹配的侧链结构以及表面化学性质，从而实现其对目标生物大分子的特异性识别和捕获。目前，人工合成聚合物纳米颗粒作为一种理想的仿生亲和配体，在蛋白质分离纯化、生物毒素去除、热激蛋白保护以及生物大分子样品前处理等方面显示出广阔的应用前景。人工合成聚合物纳米颗粒之所以能够体现出生物抗体/受体的仿生特性，主要是因为其模拟了生物大分子之间的特异性相互作用。因此，研究抗原与抗体，抗原与受体之间特有的分子识别机理对于如何设计和筛选聚合物纳米颗粒具有非常重要的借鉴作用。研究BtCry1Ac蛋白对烟草天蛾的杀虫机理表明，影响BtCry1Ac蛋白杀虫活性的关键步骤是BtCry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt-R1之间特异性的相互作用。两者之间的结合位点分别位于：BtCry1Ac蛋白结构域domainII中的loop2凸环结构上，其抗原表位的氨基酸序列为368RRPFNIGINNQQ379；钙粘蛋白Bt-R1中的钙粘重复单元CR7上，其受体表位的氨基酸序列为865NITIHITDTNNK876。因此，我们可以模拟BtCry1Ac蛋白与Bt-R1受体之间的分子识别机制，以人工合成的含有氨基酸序列Asn-Ile-Thr-Ile-His-Ile-Thr-Asp-Thr-Asn-Asn-Lys(NITIHITDTNNK)的丙烯酰胺-多肽-酰胺为功能单体(提供特异亲和力)，以亲水性单体，如丙烯酰胺(AAm)、异丙基丙烯酰胺(NIPAm)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)或者甲基丙烯酸酯(MMA)为共存单体(作为聚合物纳米颗粒的骨架材料)，来定向设计合成聚合物纳米颗粒，从而将受体蛋白结合位点代表的多肽NITIHITDTNNK引入到聚合物纳米颗粒侧链结构中。当聚合物纳米颗粒与BtCry1Ac蛋白作用时，即可通过其侧链结构中的NITIHITDTNNK与BtCry1Ac蛋白结构中的368RRPFNIGINNQQ379结合在一起。采用这种定向合成方法得到的聚合物纳米颗粒具有受体蛋白Bt-R1的仿生特点，因此可以大大提高聚合物纳米颗粒对BtCry1Ac蛋白的特异性亲和能力。以该聚合物纳米颗粒为仿生亲和配体，有望解决水、土壤以及生物介质等复杂环境中痕量BtCry1Ac蛋白的样品前处理问题，从而实现环境及生物样品中BtCry1Ac蛋白的有效监控。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于抗原-受体识别机理的Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法，以及一种以所述Bt蛋白仿生亲和材料为吸附剂，对土壤Bt蛋白进行提取分离的方法。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种Bt蛋白仿生亲和材料，它是模拟BtCry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt-R1之间的分子识别机制，以人工合成的丙烯酰胺-多肽-酰胺单体与其它共存单体反应后得到的聚合物纳米颗粒，所述多肽包含有氨基酸序列Asn-Ile-Thr-Ile-His-Ile-Thr-Asp-Thr-Asn-Asn-Lys(NITIHITDTNNK)，所述共存单体为丙烯酰胺类和/或丙烯酸酯类化合物。一种制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，它包括以下步骤：1)人工合成丙烯酰胺-多肽-酰胺单体，所述多肽包含有氨基酸序列Asn-Ile-Thr-Ile-His-Ile-Thr-Asp-Thr-Asn-Asn-Lys(NITIHITDTNNK)；2)以过硫酸铵(APS)为引发剂、四甲基乙二胺(TEMED)为催化剂，将丙烯酰胺-多肽-酰胺单体与其它共存单体反应得到聚合物纳米颗粒，所述共存单体为丙烯酰胺类和/或丙烯酸酯类化合物。所述丙烯酰胺类化合物包括但不限于丙烯酰胺(AAm)、异丙基丙烯酰胺(NIPAm)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)。所述丙烯酸酯类化合物包括但不限于甲基丙烯酸甲酯(MMA)。优选地，所述聚合反应在氮气保护氛围下，于4～40℃条件下进行，其最佳反应温度为25℃。优选地，所述丙烯酰胺-多肽-酰胺单体与其它共存单体的摩尔比为5～50：95～50，其最佳摩尔比为30：70。优选地，所述过硫酸铵在反应体系中的浓度为6～120mg/25ml，其最佳浓度为30mg/25ml。优选地，所述四甲基乙二胺在反应体系中的浓度为5～25μL/25ml，其最佳浓度为15μl/25ml。优选地，所述反应体系中含有0～30mg/25ml的表面活性剂，所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠(SDS)，其最佳浓度为10mg/25ml。一种土壤Bt蛋白提取分离方法，它包括以下步骤：首先对土壤中的Bt蛋白进行提取，然后向提取液中加入以上所述的Bt蛋白仿生亲和材料为吸附剂，调节吸附pH为6～9，对提取液中的Bt蛋白进行吸附，最后在解吸pH为10～13的条件下使吸附剂上的Bt蛋白解吸。优选地，所述吸附pH为8。优选地，所述解吸pH为10。本专利技术的有益效果是：采用本专利技术的技术方案制备的聚合物纳米颗粒，由于利用了BtCry1Ac蛋白与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Bt蛋白仿生亲和材料，它是模拟Bt Cry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt‑R1之间的分子识别机制，以人工合成的丙烯酰胺‑多肽‑酰胺单体与其它共存单体反应后得到的聚合物纳米颗粒，所述多肽包含有氨基酸序列NITIHITDTNNK，所述共存单体为丙烯酰胺类和/或丙烯酸酯类化合物。

【技术特征摘要】
1.一种Bt蛋白仿生亲和材料，它是模拟BtCry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt-R1之间的分子识别机制，以人工合成的丙烯酰胺-多肽-酰胺单体与其它共存单体反应后得到的聚合物纳米颗粒，所述多肽包含有氨基酸序列NITIHITDTNNK，所述共存单体为丙烯酰胺类和/或丙烯酸酯类化合物。2.一种制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，其特征在于包括以下步骤：1)人工合成丙烯酰胺-多肽-酰胺单体，所述多肽包含有氨基酸序列NITIHITDTNNK；2)以过硫酸铵为引发剂、四甲基乙二胺为催化剂，将丙烯酰胺-多肽-酰胺单体与其它共存单体反应得到聚合物纳米颗粒，所述共存单体为丙烯酰胺类和/或丙烯酸酯类化合物。3.如权利要求2所述的制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，其特征在于：所述聚合反应在氮气保护氛围下，于4～40℃条件下进行，其最佳反应温度为25℃。4.如权利要求2所述的制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，其特征在于：所述丙烯酰胺-多肽-酰胺单体与其它共存单体的摩尔比为5～50：95～50，其最佳摩尔比为30：7...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘名茗，陈雅露，牟建琼，万梓豪，熊周璇，王长青，刘凡，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42